Incorporación química de la sonda fluorescente FlAsH en la proteína Hha: aplicación al estudio del complejo Hha/H-NS
Chemical incorporation of fluorescent Probe flAsH on the Hha Protein:Application to the Study of complex Hha/H-NS
NOVA por http://www.unicolmayor.edu.co/publicaciones/index.php/nova se distribuye bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-SinDerivar 4.0 Internacional.
Así mismo, los autores mantienen sus derechos de propiedad intelectual sobre los artículos.
Mostrar biografía de los autores
El objetivo de esta investigación fue realizar estudios de incorporación de la sonda FlAsH como posible herramienta para el estudio in vitro e in vivo de la proteína Hha y de su interacción con H-NS. Se construyó una proteína con la secuencia específica “CCPGCC” capaz de unir la sonda fluorescente FlAsH; posteriormente se desarrollaron procesos de transformación, expresión y purificación, con los cuales se evidenció que a pesar de introducir una secuencia adicional no nativa a la proteína, se pudo obtener proteína en buena cantidad, estabilidad, rendimiento y con un alto nivel de pureza. La optimización del protocolo de incorporación del FlAsH se hizo teniendo en cuenta el rendimiento y el tiempo de reacción. El complejo FlAsH/HhaCCPGCC se caracterizó mediante fluorescencia y se comprobó mediante MALDI TOF. La incorporación HhaCCPGCC1/ FlAsH no se obtuvo en un alto porcentaje como se esperaba, por esta razón no se pudieron hacer los estudios de interacción entre el complejo de proteínas Hha y H-NS.
Visitas del artículo 181 | Visitas PDF 80
Descargas
- Madrid C, Balsalobre C, García J, Juárez A. The novel Hha/YmoA family of nucleoid-associated proteins: use of structural mimicry to modulate the activity of the H-NS famil of proteins. Mol Microbiol. 2007;63:7-14.
- Varshavsky, A., Nedospasov, S. A., Bakayev, V. V., Bakayeva, T. G. and Georgiev, G. P. Histone-like proteins in the E. coli chromosome. Nucl. Acids Res. 1977:4: 2725-2745.
- Lammi M, Paci M, Pon CL, Losso MA, Miano A, Pawlik RT, et al. Proteins from the prokaryotic nucleoid: biochemical and 1H NMR studies on three bacterial histone-like proteins. Adv Exp Med Biol. 1984;179:467-477.
- Spassky A, Rimsky S, Garreau H, Buc H. H1a, an E. coli ADN-binding protein which accumulates in stationary phase, strongly compacts AND in Vitro. Nucleic Acids Res. 1984;12.5321-5340.
- Schröder O, Wagner R. The bacterial regulatory protein H-NS- -a versatile modulator of nucleic acid structures. Biol Chem. 2002;383:945-960.
- Pons I. La familia de proteínas Hha-YmoA: estudios estructurales y papel regulador en Yersinia Enterocolitica. Tesis Doctoral. Universitat de Barcelona, 2006.
- Azam TA, Ishihama A. Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and ADN binding affinity. J Biol Chem. 1999;274:33105-33113.
- Dorman CJ, Hinton JC, Free A. Domain organization and oligomerization among H-NS-like nucleoid-associated proteins in bacteria. Trends Microbiol. 1999;7:124-128.
- Badaut C, Williams R, Arluison V, Bouffartigues E, Robert B, Buc H, Rimsky S. The degree of oligomerization of the H-NS nucleoid structuring protein is related to specific binding to ADN. J Biol Chem. 2002;277:41657-41666.
- Esposito D, Petrovic A, Harris R, Ono S, Eccleston JF, Mbabaali A, et al. H-NS oligomerization domain structure reveals the mechanism for high order self-association of the intact protein. J Mol Biol. 2002;324:841- 850.
- Bloch V, Yang Y, Margeat E, Chavanieu A, Augé MT, Robert B, et al. The H-NS dimerization domain defines a new fold contributing to AD recognition. Nat Struct Biol. 2003;10:212-218.
- Dorman CJ. H-NS: A universal regulador for a dynamic genome. Nat Rev Microbiol 2004;12:179-184.
- Godessart N, Muñoa FJ, Regue M, Juárez A. Chromosomal mutations that increase the production of a plasmid-encoded haemolysin in Escherichia coli. J Gen Microbiol. 1988;134:2779-2787.
- Yee A, Chang X, Pineda-Lucena A, Wu B, Semesi A, Le B, et al. An NMR approach to structural proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:1825-1830.
- Nieto JM, Madrid C, Miquelay E, Parra JL, Rodríguez S, Juárez A. Evidence for direct protein-protein interaction between members of the enterobacterial Hha/YmoA and H-NS families of proteins. J Bacteriol. 2002;184:629-635.
- Rodríguez S. Interacción entre proteínas de las familias H-NS y Hha / YmoA: regulación de la expresión génica en Enterobacteriaceae. Tesis Doctoral. Facultad de Biología. Universitat de Barcelona, 2005.
- Cordeiro T. Dynamic and structural aspects of the interaction between Hha and H-NS. Diploma of Avanced Studies in Organic Chemistry. Universitat de Barcelona- IRB- Barcelona Science Park, 2008.
- García J, Cordeiro TN, Nieto JM, Pons I, Juárez A, Pons M. Interaction between the bacterial nucleoid associated proteins Hha and H-NS involves a conformational change of Hha. Biochem J. 2005;388:755-762.
- Rimsky S. Structure of the histone-like protein H-NS and its role in regulation and genome superstructure. Curr Opin Microbiol. 2004;7:109- 114
- Cordeiro T. Insights into the Interaction between Nucleoid-associated Proteins, Hha and H-NS. Formal Training Report. Platform Biomolecular RMN , Barcelona Science Park, Universitat de Barcelona. 2005.
- Zhang J, Campbell RE, Ting AY, Tsien RY. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3:906-918.
- Stroffekova K, Proenza C, Beam KG. The protein-labeling reagent FLASH-EDT2 binds not only to CCXXCC motifs but also nonspecifically to endogenous cysteine-rich proteins. Pflugers Arch. 2001;442:859-866.
- Adams SR, Campbell RE, Gross LA, Martin BR, Walkup GK, Yao Y, New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 2002;124:6063-6076.
- Fernández De Alba, C. Estudio de la interacción entre proteínas asociadas al nucleoide mediante anisotropía de fluorescencia. Máster en Química orgánica experimental. Universitat de Barcelona, Institut de Recerca Biomédica de Barcelona, 2007
- -------------------------------------------------------------------------------
- DOI: http://dx.doi.org/10.22490/24629448.412