Presencia de Integrones Clase 1 en Aislamientos de Staphylococcus epidermidis de las unidades de neonatología del Instituto Materno Infantil de Bogotá
Gladys Pinilla M.Sc1., Liliana Muñoz M.Sc.1, Eva Amanda Gallego M.Sc.1, Bibiana Chavarro B.1, Jennifer Fandiño1
Grupo Rema: Relaciones microbianas y epidemiológicas aplicadas al laboratorio clínico y molecular. Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.
1Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Correspondencia: gpinillab@unicolmayor.edu.co
Recibido: 25-09-06 / Aceptado: 27-10-06
En este estudio, se determinó la presencia de integrones clase 1 en Staphylococcus epidermidis, provenientes de hemocultivos y puntas de catéter, que causaron infección nosocomial en las unidades neonatales del Instituto Materno Infantil de Bogotá, Colombia. De las 46 cepas estudiadas, se detectó la presencia del gen intI 1 en 21 de los aislamientos (45.7%). Este hallazgo, pionero en cepas bacterianas aisladas en neonatos, sugiere la necesidad de buscar cassettes genéticos que confieren resistencia a los diferentes antimicrobianos, para definir esquemas de tratamiento de infecciones nosocomiales causadas por estos microorganismos.
Palabras clave: antimicrobianos, cassettes genéticos, genoma bacteriano, integrones, neonato, plásmidos.
In this study, presence of class 1 integrons in Staphylococcus epidermis was determined as coming from hemocultures and catheter points which caused nasocomial infection in newborn intensive care units of Instituto Materno Infantil in Bogotá, Colombia. From the 46 studied strains, intl1 gene was detected in 21 of them (45.7%). This finding, pioneer in bacterial strains isolated in newborns, suggests the necessity to look for gene cassette which give resistance to the different anti microbial entities to define nosocomial infection treatment schemes caused by these microorganisms.
This is the first time mechanism of resistance to aminoglycoside and other antimicrobials in Colombian Gram positive strains is studied. We suggest that it is important to carry out assays with gene cassette for different antibiotics of nosocomial infection to provide a better treatment selection.
Key words: antimicrobial, gene cassette, genome bacterial, integrons, newborn, plasmids.
El Staphylococcus epidermidis es el germen más frecuente aislado en las unidades de neonatología, ha sido reconocido en las ultimas décadas como el mayor causante de las infecciones nosocomiales en recién nacidos, presentando un alto índice de morbi-mortalidad y multiresistencia a los antibióticos (1, 2).
Dentro de los mecanismos de resistencia a los antimicrobianos por transferencia horizontal de genes, se encuentra una nueva familia de elementos de ADN móviles denominados integrones; se localizan en el genoma bacteriano, en plasmidos o en transposones (3, 4, 5, 6).
La estructura básica del integron consiste en dos segmentos conservados en los extremos 5’ y 3´, separados por un segmento de longitud variable, donde se insertan cassettes genéticos con uno o más genes que confieren resistencia a los antibióticos, mediante un sistema de recombinación sitio-especifica (11, 12).
En el extremo 5´ se encuentra el gen intI, que codifica para una proteína con actividad de recombinasa o integrasa; contiguo a este, se localiza la secuencia attI, sitio de recombinación especifica donde se integran cassettes genéticos separados por pequeñas regiones intergénicas de aproximadamente 10 pb. Entre intI y attI están los promotores Pc y Pi, que codifican para la expresión de cassettes génicos y para la expresión de intI1 respectivamente (Figura 1) (12, 13).
La enzima IntI permite la interacción entre attl y el sitio attC, el cual une los extremos del cassette genético y facilita la integración en la zona variable del integron (14). En el extremo 3’ del integron clase 1, se han descrito varios genes que confieren resistencia a compuestos de amonio cuaternario (qacEÄ1), que hacen parte de algunos antisépticos y desinfectantes; así como de genes que determinan resistencia a las sulfonamidas (sul1) y el gen orf 5 cuya función se desconoce hasta el momento (15).
Figura 1. Estructura del integron clase 1.
El integron clase 1 es el más estudiado en bacterias Gram negativas, mientras que su presencia en bacterias Gram positivas es menos conocida (7, 8, 9, 10). En este estudio se determinó la presencia de integrones clase 1, en aislamientos de S. epidermidis provenientes de hemocultivos y cultivos de punta de catéter de las unidades de neonatología del Instituto Materno Infantil de Bogotá (IMI). La determinación de la presencia de integrones y su relación con cassettes genéticos de resistencia antimicrobiana, especialmente para aminoglucosidos y betalactamicos, utilizados en las unidades de neonatología, permitirá la intervención más eficaz en el tratamiento de infecciones nosocomiales causadas por S. epidermidis.
Aislamientos
Se estudiaron 46 cepas de S. epidermidis aisladas a partir de hemocultivos y cultivos de puntas de catéter provenientes de 38 recién nacidos admitidos en las unidades de neonatología del IMI durante el periodo comprendido entre el 21 de noviembre de 2003 y el 20 de Mayo de 2004. La identificación de las especies se realizó por el método MicroScan (Roche Biocare, Canadá).
Análisis por Bioinformática
La búsqueda del gen de la integrasa tipo I (intl1), se realizó a partir de secuencias reportadas en la base de datos del NCBI (Nacional Center Biotechnology Information), pertenecientes a los géneros Klebsiella, Salmonella, Serratia, Acinetobacter, y Citrobacter.
Dichas secuencias se utilizaron para la construcción de una secuencia consenso mediante el programa Multalin (disponible en red). A partir de esta secuencia consenso se seleccionó la región más conservada para el diseño de oligonucleotidos empleando el programa Primer3 (20).
Amplificación del gen intI1 por reacción en cadena de la polimerasa
La extracción de DNA se realizó a partir de un cultivo puro, siguiendo el protocolo del fabricante (Kit Wizard® Genomic DNA Purification A1123, Promega, USA). La amplificación del gen intl1 se realizó por PCR utilizando: oligonucleótidos 1.0 μM, (sentido: CGAACCGAACAGGCTTATGT; antisentido: AGCACCTTGCCGTAGAAGA) GoTaq polimerasa 1U, mezcla de dNTPs 200 μM, DNA 150 ng/μl para un volumen final de 20 μl. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94°C por 4 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, anillamiento a 53°C por 45 segundos, extensión a 72°C por 45 segundos y una extensión final a 72°C por 7 minutos. La detección del producto de amplificación de aproximadamente 188 pb, se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, seguido de tinción con bromuro de etidio. Como cepa control se utilizó un aislamiento clínico de Salmonella typhi, portador del gen intl1 (Gen Bank EF051039).
La tabla 1 muestra la distribución de frecuencias de las cepas provenientes de hemocultivos y punta de catéter relacionadas con la presencia o ausencia del integron clase I.
Figura 2. Amplificación del gen intl 1. M: Marcador de peso molecular de 50 pb.; líneas. 2 - 6 y 8 cepas de ECN positivas para el gen intI1 correspondientes a un tamaño de 188 pb. Línea 7 Cepa control Salmonella tiphy (aislamiento clínico, portador del gen intl1). Neg: Control negativo.
Tabla 1. Frecuencia de presentación del integron clase I (gen intl1) en muestras de hemocultivo y puntas de catéter.
Se amplificó el gen intl1 en el genoma bacteriano, que corresponde a un integron de resistencia clase 1, siendo este el más estudiado, debido a que se presenta con mayor frecuencia en aislamientos clínicos. De los 46 aislamientos de S. epidermidis, 21 (45.7%) fueron positivos para el gen intI1. La presencia del integron clase 1 sólo había sido reportada en ECN, en un estudio realizado en China, donde la frecuencia fue del 100%; sin embargo, dicho estudio no fue realizado en neonatos (7).
Los integrones se han reconocido como elementos móviles importantes en la evolución del genoma bacteriano y se consideran como uno de los mecanismos genéticos responsables de la resistencia a los antibióticos de amplio espectro usados en el ámbito hospitalario, en aislamientos clínicos de bacterias Gram negativas.
Recientemente se encontró la primera evidencia de integron clase 1 en microorganismos Gram positivos asociados a infección nosocomial (19).
Los integrones clase 1 podrían ser mediadores de resistencia a diferentes antibióticos en aislamientos clínicos de bacterias Gram positivas, como S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, Estreptococcus sp. Entre otros, que presentaron resistencia a diferentes antimicrobianos como Clindamicina, gentamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, eritromicina, tetraciclina (7).
Los ECN han sido subestimados como agente causal de infección. La presencia del integron clase 1 en el 45.7% de los aislamientos analizados, muestra la importancia de la determinación de la presencia de otras clases de integrones (clases 2 y 3), así como el estudio de los cassettes genéticos que median resistencia a los aminoglucósidos, utilizados en el tratamiento de infecciones en las unidades de neonatología. La unión entre los hallazgos clínicos y moleculares contribuirá en la definición de esquemas de tratamiento adecuados, así como en la implementación de programas para la prevención y control de patógenos que son considerados por muchos clínicos como simples contaminantes.
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