Evaluación de la congelación para conservación de especies autóctonas bacterianas
Ligia Consuelo Sánchez Leal MSc1, Lucía Constanza Corrales Ramírez MSc1
1Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Facultad Ciencias de la Salud, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.
Correspondencia: lcorralesr@unicolmayor.edu.co
Recibido: 22-09-05 / Aceptado: 27-10-05
Palabras clave: congelación, descongelación, viabilidad bacteriana, actividad metabólica.
Key words: freezing, defrost, viability, metabolic activity.
El Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá- Colombia, desde hace más de 20 años posee una diversidad de microorganismos bacterianos, los cuales han sido conservados con almacenamientos a corto plazo (congelación a 4°C), con pases continuos en el caso de microorganismos bacterianos de difícil recuperación y a mediano plazo utilizando Agar Base Sangre BAB en tubo recto a temperatura ambiente con resultados satisfactorios. El mayor problema de estos métodos son las resiembras porque ello constituye una posibilidad de cambio en su comportamiento tanto genotípico como fenotípico y por lo tanto, si bien estos microorganismos conservan sus características por un tiempo, no se tendría certeza de que el microorganismo haya tenido cambios transitorios o permanentes.
Esta observación llevo a valorar otros métodos que sean más reproducibles y confiables con el fin de garantizar la calidad del microorganismo conservado y constituir una oferta de servicios competitiva a la altura de instituciones nacionales e internacionales.
Entre estos métodos se consideran la liofilización y congelación a diferentes temperaturas como los más utilizados. El análisis llevó a escoger la congelación para la conservación por las ventajas ofrecidas: facilidad para procesar los microorganismos, confiabilidad de los resultados, estabilidad de las cepas de microorganismos y el costo. Al respecto, Ann Tanghe y Frederick Dumont (1, 2) hacen una revisión de los determinantes de tolerancia a la congelación y concluyen que los microorganismos han desarrollado mecanismos de adaptación al ambiente de estrés que genera la congelación. Un factor que se debe considerar en este método es el relacionado con las sustancias que brindan protección a los posibles efectos dañinos causados por las bajas temperaturas como la formación de cristales de hielo intracelular. Han Bumsoo y Jason Acker (3,4,5) establecen que el mecanismo de daño celular por congelación más significativo es la formación de cristales y que es necesario entender dicho mecanismo para prevenirlo es así, como se han considerado como protectores diversas sustancias que son efectivas y que evitan la formación de estos cristales. Hubálek y Arlet de Saab (6-9) presentan una revisión sobre las sustancias criopreservantes más utilizadas, sus ventajas y limitaciones, producto del análisis de estas, se optó por utilizar el glicerol.
Figura 1. Protocolo para la evaluación de la congelación para conservación de especies autóctonas bacterianas
Otro aspecto considerado fue el relacionado con la diversidad en el comportamiento metabólico, auxotrofismo de los microorganismos seleccionados para el estudio, el cual llevó a establecer una normatividad o estandarización por género y en algunos casos por especie que garantizara el éxito en el proceso congelación . descongelación.
Esta investigación constituyó la primera fase del proyecto .Métodos óptimos de conservación de la microdiversidad autóctona.. El objetivo de esta fase fue evaluar el método de congelación como método de conservación de la microdiversidad autóctona en 18 especies bacterianas, indispensables para el desarrollo de procesos académicos, de investigación y de extensión los cuales formarán parte de la Colección de Cultivos del Programa de Bacteriología de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.
Selección de microorganismos:
Los criterios para la selección fueron:
1. Especies bacterianas que conforman la microflora autóctona ambiental.
2. Especies bacterianas de fácil crecimiento en condiciones no naturales (ex situ).
3. Especies bacterianas de difícil crecimiento en condiciones no naturales (ex situ)
4. Especies bacterianas que tienen como hábitat suelos o agua y se consideran posibles patógenos para los seres humanos.
5. Especies bacterianas de importancia clínica: (i) posibles patógenos en humanos y animales, (ii) de importancia industrial en el control de calidad en procesamiento de alimentos, (iii) preservación de su hábitat natural, (IV) de importancia biotecnológica utilizados como sustratos de utilización en diversos procesos.
No se utilizaron microorganismos bacterianos anaerobios estrictos.
Los microorganismos seleccionados fueron:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Lysteria monocytogenes, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Salmonella typhi, Pseudomona fluorescens, Morganella morganii, Citrobacter freundii, Shigella flexnerii, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Acinetobacter boumanii y Acinetobacter calcoaceticus.
Temperatura de congelación:
El método elegido para la conservación de los microorganismos fue -20ºC.
Medios de cultivo:
Se utilizó caldo infusión cerebro corazón (BHI) preparado de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial (Difco). Se llevo a esterilizar en autoclave horizontal a 121 libras de presión por 15 minutos y se almacenaron en crioviales con capacidad de 1.2 mls.
Conservante:
Se utilizó glicerol al 10%, el cual fue añadido a cada tubo, una vez sembrada la suspensión de células bacterianas a congelar.
Desarrollo de pretratamientos:
Viabilidad: los microorganismos fueron inoculados en los medios selectivos para su crecimiento. Se incubaron a la temperatura óptima de cada uno entre 18 y 24 horas y se observó su crecimiento. La siembra se realizó con asas calibradas para garantizar el mismo inóculo.
Pureza e Identificación microscópica mediante coloración de Gram: se observó el crecimiento en los medios selectivos y se comprobó si las colonias presentaban homogeneidad. Se procedió a realizar una coloración de Gram de 3 colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfológica con el microorganismo esperado.
Actividad enzimática: se realizaron montajes de pruebas bioquímicas automatizadas a partir del crecimiento obtenido a las 18 horas en los medios selectivos, siguiendo los procedimientos establecidos para ello.Alas 18 horas se aplicaron los reactivos solicitados por el sistema y se procedió a su lectura.
Preparación de microorganismos a congelar
Una vez confirmada la viabilidad, pureza, identificación microscópica por coloración de Gram y actividad enzimática de los microorganismos, se procedió a preparar suspensiones de bacterias con 7.5 x 108 UFC/ml, Escala de Mc Farland 4, posteriormente se colocó en cada vial de medio BHI, 100 µl de bacteriasen suspensión y se agregó el glicerol al 10% (100 µl por 1 ml de medio) y se llevo a congelar en forma inmediata a -20ºC.
Descongelación
El procedimiento para la descongelación de los en estudio fue:
1. Se retiró del vial congelado a -20ºC y verific que estuviera bien cerrado.
2. Se espero hasta la descongelación completa del vial antes de realizar la recuperación de los microorganismos.
3. El medio de cultivo líquido elegido para reactivar los microorganismos fue caldo BHI, preparado en tubos de 13 x 100 en cantidad de 3 ml; se preparó
5 días antes y se conservó entre 2 y 8 °C.
4. Se sembró una asada de cada microorganismo con asa calibrada estéril y se inoculo en el BHI a 37°C por tres (3) horas, antes de ser sembrados
5. Los viales con los microorganismos fueron también colocados a 37ºC por tres horas para realizar una siembra directa en los medios selectivos.
6. Los medios de cultivo selectivos elegidos para la recuperación de los 18 microorganismos fueron: agar sangre, agar Mac. conkey y agar nutritivo con NaCl al 1% (Vibrio cholerae). Los cuales se ambientaron por 15 minutos a 37°C antes de ser sembrados.
7. A las tres (3) horas, se sembraron en los medios selectivos los microorganismos de los viales descongelados y del BHI ambientados y se incubaron a 37°C por 18 horas.
8. La siembra se realizó por doble estría. Se utilizó la misma caja 50/50 con división para verificar crecimiento y viabilidad desde el BHI y el vial descongelado.
9. Los medios selectivos inoculados se colocaron a 37ºC por 24 horas .
10. Se realizó lectura de las siembras a las 24 y 48 horas para observar viabilidad
Realización de Post pruebas
Se confirmó viabilidad, pureza, identificación microscópica por coloración de Gram y actividad enzimática en los 90 días a partir del momento en que se congelaron los microorganismos.
Resultados
Ver Tabla 1. Resultados, en la página siguiente.
Preprueba
Los 18 microorganismos utilizados como muestra fueron identificados plenamente en el laboratorio por crecimiento en medios selectivos, coloración de Gram
y pruebas bioquímicas automatizadas, las cuales reportaron entre un 98 y 99% de confiabilidad.
El origen de estos microorganismos está consignado de acuerdo con el Protocolo de depósito del sistema de colección de cultivos del Programa de Bacteriología de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca en la ficha de cada microorganismo.
Posprueba
Viabilidad
Al observar los medios de cultivo selectivos (agar sangre, agar Mac Conkey y Agar nutritivo con NaCl al 1% (Vibrio cholerae) en los que se sembraron los microorganismos congelados, se evidenció poco crecimiento, entre 5 y 20 UFC. Sin embargo, el crecimiento en el medio líquido caldo BHI evidenció un crecimiento mayor a 108 UFC a las 24 horas de incubación. Por esta razón se tomó la totalidad de los caldos BHI y los microorganismos se sembraron nuevamente en medios selectivos específicos, se incubaron por 24 horas a 37ºC y se observó nuevamente la viabilidad. El crecimiento estuvo entre 60 y 100 UFC en todos los casos con esta nueva siembra, lo cual permite evidenciar que los microorganismos requieren un medio que les permita recuperar su actividad enzimática en forma adecuada.
Los resultados obtenidos con S. pneumoniae demuestran que probablemente el método de congelación a -20°C no es el más adecuado por cuanto no se observa crecimiento en el cultivo directo del vial congelado, ni en el preincubado por 3 horas en caldo BHI y el crecimiento obtenido en el caldo BHI por 18 horas mostró crecimiento mixto en donde no fue posible recuperar el microorganismo (10,11).
Pureza
No hubo contaminación de los microorganismos con otras especies, ni géneros. La homogeneidad de las colonias y la identificación microscópica con tinción de Gram permitieron realizar esta confirmación. Sin embargo, se pudo evidenciar que algunos bacilos Gram negativos presentaron cambios estructurales al ser observados al microscopio como fue el caso de la Klebsiella oxytoca que presentó acomodación en empalizada no característica.
Tabla 1. Resultados
Actividad enzimática
Los resultados obtenidos por pruebas automatizadas con las bacterias Gram positivas reportaron una confiabilidad de 90 al 99%. Sin embargo, algunas bacterias Gram negativas como Citrobacter freundii, Morganella Morganii y Shigella flexnerii evidenciaron cambios en algunas de sus reacciones bioquímicas características, las cuales fueron recuperadas después de dos resiembras más en sus medios selectivos.
Los resultados obtenidos permiten confirmar que la actividad bioquímica de la bacteria se ve afectada por el estrés, pero que es un estado transitorio. Cuando el microorganismo se estabiliza y se elimina la causa de estrés, los procesos moleculares son recuperados en su totalidad. Sin embargo, el estrés producido por el procedimiento de congelación debe ser mitigado en el momento del procedimiento de descongelación y el medio que se provea a los microorganismos bacterianos debe ser líquido para que facilite el intercambio molecular iónico y se restituya la actividad bioquímica de la membrana rápidamente.
Se evidencio que el medio líquido utilizado, caldo BHI, facilitó más la recuperación del equilibrio iónico de la membrana y por lo tanto la producción de ATP para reestablecer su actividad bioquímica. El estrés parece jugar un papel importante en la recuperaciónde estas características y varios investigadores se han referido a este tema. Por esta razón, es esencial considerar dentro del protocolo de descongelación un paso inicial de acomodación o recuperación de la actividad bioquímica que disminuya al máximo el estrés en el que se ha encontrado por la congelación. (8). Algunos autores incluso han llegado a referirse en términos de resucitación, cuando el microorganismo vuelve a recuperarse después de un proceso de congelación (8). Así mismo, se ha planteado como las bacterias están capacitadas con una maquinaria biomolecular que incluye proteínas anti congelantes (5,9) y se ha establecido que los microorganismos en congelación o en estado de .hambre., starvatión survival - SS, conservan una alta actividad metabólica para soportar cambios metabólicos y activar mecanismos de reparación, relacionados con el mantenimiento de la integridad celular y de esta forma con la capacidad de ser cultivable (8).
La protección de estas células vivas bacterianas con un crioprotector es necesaria. El glicerol ha demostrado ser una de las mejores sustancias por cuanto sus características moleculares le permiten simular una vitrificación alrededor de la bacteria, lo cual impide que la formación de cristales de hielo lesione las membranas citoplasmáticas.
Se pudo evidenciar que algunos bacilos Gramnegativos presentaron cambios estructurales al ser observados al microscopio como fue el caso de la Klebsiella oxytoca que presento acomodación en empalizada no característica. Este resultado hace pensar que la hipótesis planteada sobre el estrés por congelación para algunos microorganismos constituye una respuesta más evidente que para otros. Es así, como las bacterias Gram negativas parecen presentar más cambios moleculares de adecuación estructural en condiciones de estrés por congelamiento que las bacterias
Gram positivas. Este fenómeno esta relacionado con la conformación química de su membrana y por otro tipo de mensajes o señalizaciones, quórum sensing (8).
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