Optimización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para la Detección del gen B1 de T. gondii
Optimization of Polymerase Chain Reaction for the detection of the B1 gene of T. gondii
Liliana Jazmín Cortés Cortés1, Diana Carolina Hernández Castro1, Mónica Mantilla2, María Isabel Medina2, Sofía Duque1.
1Instituto Nacional de Salud. Dirección de Investigación en Salud Pública, Subdirección de Investigación Científica y Tecnológica, Grupo de Parasitología.
2Hospital Simón Bolívar E.S.E.
Correspondencia: jcortes@ins.gov.co.
Objetivo: Optimizar las condiciones de amplificación del gen B1 (35 copias en el genoma) para la detección de ADN de T.gondii en casos probables de toxoplasmosis cerebral. Materiales y métodos: Se realizó extracción de ADN a partir de exudado peritoneal de ratones inoculados con la cepa RH de T. gondii obteniendo 17 ml con una concentración inicial de 1x107 parásitos/ml. Se optimizaron las condiciones de PCR del gen B1. Resultados: Se obtuvo amplificación de un fragmento de 132 pb a partir de ADN obtenido de diluciones seriadas desde 1x106 a 1x10-1 parásitos por ml, estableciéndose un límite de detección de 1 taquizoíto de T. gondii.
Palabras clave: toxoplasmosis, optimización, reacción en cadena de la polimerasa, gen B1, detección.
Objective: This study aimed at optimizing the amplification conditions of the B1 gene (35 copies in the genome) of T. gondii in cases of possible brain toxoplasmosis. Materials and methods: DNA was extracted from the peritoneal exudate of mice inoculated with the RH strain of T. gondii. Total exudate volume was 17 mL with a concentration of 1x107 parasites/mL. PCR conditions for the B1 gene were further optimized.Results: Serial dilutions from 1x106 to 1x10-1 parasites/mL were needed for amplifying a fragment of 132 bp . This set the detection limit for 1 T. gondii tachyzoite.
Key words: toxoplasmosis, optimization, polymerase chain reaction, B1 gene detection.
La toxoplasmosis es una zoonosis mundial cuyos huéspedes definitivos son los felinos y como huéspedes intermediarios se encuentran el hombre y la mayoría de animales de sangre caliente (1). En el humano, la mayoría de las infecciones por T. gondii son subclínicas, sin embargo una infección severa puede ocurrir en los pacientes inmunocomprometidos dentro de los que se encuentran los pacientes con VIH/SIDA y con tumores malignos (2). En los pacientes con SIDA, a pesar de la terapia antirretroviral, la toxoplasmosis cerebral (TC) es la infección oportunista más frecuente (3).
La optimización de las condiciones de amplificación por PCR para el gen B1 de T. gondii, permitirá ser la base para realizar el diagnóstico molecular en pacientes con probable toxoplasmosis cerebral a través de la técnica de PCR en muestras biológicas de Líquido céfalo-raquídeo y sangre, ya que en Colombia, el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral se realiza presuntivamente mediante hallazgos clínicos, radiológicos, serológicos y la respuesta a la terapia anti-Toxoplasma (4).
Es importante tener en cuenta que la mayoría de microorganismos que producen cuadros neurológicos en pacientes inmunosuprimidos (T. cruzi, Cryptococcus neoformans, Esptein-Barr entre otros) también causan sintomatología y se evidencian hallazgos radiológicos similares a los que se presentan en la TC, por lo que se resalta la importancia de realizar la PCR en LCR y sangre para hacer diagnóstico diferencial de TC y formular el tratamiento adecuado para el paciente (5).
Mantenimiento de la cepa RH de T. gondii en modelo animal.
Se realizó el mantenimiento de la cepa de referencia RH de T. gondii (ATCC 50174) a través de pases sucesivos en ratones de la cepa ICR-CD1, machos y hembras, de 18 a 20 días de edad, mediante la inoculación intraperitoneal con 0,3 ml de taquizoitos a una concentración de 1 x106 parásitos/ml.
Se mantuvieron en el bioterio los animales inoculados, debidamente identificados, siguiendo las normas CICUAL (6). Se revisaron diariamente para detectar cambios en el comportamiento como letargia e inactividad y cambios físicos como irritación ocular, hepato o esplenomegalia, piloerección que evidenciaron la infección por T. gondii dándose así punto final al experimento y mediante eutanasia de los ratones en cámara de CO2 recolectar del exudado de éstos un mínimo 106 taquizoítos del parásito/ml.
Extracción de ADN parasitario.
Se realizó la extracción del ADN parasitario a partir del exudado peritoneal v/v con Clorhidrato de Guanidina, con una concentración de 1x106 parásitos/ml, con el kit PureLinkTM Genomic DNA Kits, siguiendo las instrucciones del fabricante así: Se resuspendieron 200 µl de cada una de las muestras (cepa de referencia RH de T. gondii ) en 200 µl de Solución Salina estéril, se adicionaron 20 µl de Proteinasa K a la muestra, no se adicionó RNAsa A a la muestra, porque puede producir inhibición, se mezcló suavemente con vórtex, se incubó por 2 minutos a temperatura ambiente, se adicionaron 200 µl de PureLinkTM Genomic Lysis/Binding Buffer y se mezcló suavemente con vórtex. Se incubó a 55°C por 10 minutos para promover la digestión proteica. Se adicionaron 200 µl de etanol (96-100%) al lisado. Se mezcló suavemente con vórtex por 5 segundos.
Unión del ADN. Se tomó una columna PureLinkTM Spin Column del paquete. Se adicionó el lisado obtenido en el paso anterior. Se centrifugó la columna a 10.000 g por 3 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el tubo colector y se transfirió la columna a un nuevo tubo colector.
Lavado de ADN. Se adicionaron 500 µl de Buffer de Lavado 1 a la columna. Se centrifugó la columna a 10.000 g por 3 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el tubo colector y se transfirió la columna a un nuevo tubo colector. Se adicionaron 500 µl de Buffer de Lavado 2 a la columna. Se centrifugó la columna a máxima velocidad por 3 minutos a temperatura ambiente.
Elución del ADN. Se transfirió la columna a un tubo eppendorf estéril de 1,5 ml. Se adicionaron 100 µl de buffer de elución del kit. Se Incubó a temperatura ambiente por 2 minutos. Se centrifugó la columna a máxima velocidad por 3 minutos a temperatura ambiente. Se descartó la columna, el tubo colector es el que contiene el ADN. Se almacenó el ADN a -40°C.
Cuantificación de ADN. Se realizó la cuantificación del ADN obtenido mediante espectrofotómetro NanoDropTM 2000 utilizando 2 μl de la muestra conservando la tensión superficial y la estática entre dos fibras ópticas sin la necesidad de utilizar diluciones.
Optimización de la técnica de PCR.
Se realizaron los análisis moleculares con el ADN del parásito, extraído a partir de exudado peritoneal de ratones inoculados cepa ICR-CD1.
Se utilizaron los oligonucleótidos reportados por Costa JM y Bretagne S (7) y tomando como base las condiciones de amplificación para el gen B1 informadas por Reischi y col. (8), se optimizaron las temperaturas óptimas de hibridación (Tms) de los oligonucleótidos, el tamaño del fragmento esperado, el tiempo de desnaturalización como el de extensión, el número de ciclos y el tiempo del ciclo de extensión final.
Determinación de la sensibilidad de la técnica de PCR para la detección del gen B1 de T. gondii.
Se determinó la sensibilidad para la detección del gen B1 del parásito con diferentes concentraciones de ADN de la cepa RH de T. gondii. Para establecer la concentración de ADN obtenida se realizó la cuantificación por espectrofotometría con el NANODROP 2000 y a partir de esta concentración se prepararon diluciones de 1x106 parásitos/ml, 1x105 parásitos/ml, 1x104 parásitos/ml, 1x103 parásitos/ml, 1x102 parásitos/ml, 1x101 parásitos/ml, 1x100 parásitos/ml, 1x10-1 parásitos/ml; para determinar la mínima cantidad de ADN detectada por los oligonucleótidos del gen B1
Ensayos de exclusividad de la técnica de PCR para la detección del gen B1 de T. gondii.
Se determinó la especificidad de los oligonucleótidos mediante la amplificación de ADN de otros microorganismos como Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi y Leishmania braziliensis.
Luego de la extracción de ADN, se realizó la respectiva cuantificación obteniéndose una concentración promedio de ADN parasitaria de 28.5ng/ml.
La mezcla de reacción para la amplificación del gen B1 fue optimizada así: GoTaq Hot Start Green Master Mix 1X, oligonucleótidos directo y reverso 4 pM y 5 µl ADN para un volumen final de 25 µl. Las condiciones de amplificación optimizadas para el gen B1 se encuentran en la Tabla 1.
La visualización del producto de amplificación, se realizó mediante una electroforesis en gel de agarosa (2%), teñido con Gel Red.
En cuanto al Límite de detección de PCR para detección de T. gondii la mínima concentración de ADN detectada por los oligonucleótidos del gen B1, corresponde a la dilución 100, es decir a 1 taquizoíto de T. gondii. Figura 1.
Mediante los ensayos de exclusividad de la técnica de PCR para la detección del gen B1 de T. gondii se determinó la especificidad de los oligonucleótidos mediante la amplificación de ADN obtenido de otros microorganismos como P. falciparum, T. cruzi y L. braziliensis. Al amplificar el ADN de estos organismos con los oligonucleótidos para el gen B1 bajo las mismas condiciones de amplificación no se observó ninguna reacción cruzada. Figuras 1 y 2.
La utilidad de los métodos biológicos moleculares ha sido investigada como herramienta complementaria del manejo clínico de afecciones como la toxoplasmosis cerebral. El uso de la técnica de PCR ha sido ampliamente recomendado para amplificar y posteriormente detectar el ADN de microorganismos en una variedad de líquidos y tejidos, particularmente aquellos que son difíciles para su detección directa por la complejidad de su aislamiento a partir de cultivos (9) o por el volumen reducido de la muestra, en cuyo caso ha demostrado ser muy útil (10).
La técnica de PCR para la detección del gen B1 de T. gondii, que se ha descrito puede ser utilizada para la confirmación diagnóstica de toxoplasmosis cerebral en muestras de sangre y LCR (11) la cual podría implementarse en los Laboratorios clínicos de Instituciones de Salud de tercer y cuarto nivel.
A través de este trabajo se optimizaron las condiciones de una técnica de PCR que permite la detección de T. gondii. Por medio de los ensayos de límite de detección se pudo establecer que esta técnica es capaz de detectar mínimo un taquizoíto presente en la muestra examinada y mediante los ensayos de exclusión se determinó que no se presentan reacciones cruzadas con otro patógenos (como Virus Epstein Barr, Virus JC, T. cruzi o Criptococcus neoformans entre otros) (12) que producen alteraciones cerebrales en pacientes inmunosuprimidos, mostrando que el gen B1 es altamente específico para T. gondii (13).
1. Priest J, Moss D, Arnold B, Hamlin K, Jones C, Lammie P. Seroepidemiology of Toxoplasma in a coastal region of Haiti: multiplex bead assay detection of immunoglobulin G antibodies that recognize the SAG2A antigen. Epidemiol Infect. 2015; 143(3): 618-30. doi: http://dx.doi.org/10.1017/S0950268814001216.
2. Ahmadpour E, Daryani A, Sharif M, Sarvi S, Aarabi M, Mizani A, et. al.Toxoplasmosis in immunocompromised patients in Iran: a systematic review and meta-analysis.J Infect Dev Ctries. 2014; 15(12):1503-10. doi: http://dx.doi.org/10.3855/jidc.4796.
3. Meira C, Pereira-Chioccola V, Vidal J, de Mattos C, Motoie G, Costa-Silva TA, et. al.Cerebral and ocular toxoplasmosis related with IFN γ, TNF-, and IL-10 levels. Front Microbiol. 2014; 5:492. doi: http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2014.00492.
4. Tonini R, Vidal J, Vera L. Molecular diagnosis of cerebral toxoplasmosis: comparing markers that determine Toxoplasma gondii by PCR in peripheral blood from HIV-infected patients The Brazilian Journal of Infectious Diseases. 2010; 14(4): 346-50.
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6. Resolución 458 de 2011, Instituto Nacional de Salud.
7. Bretagne S, Costa JM, Vidaud M, Van Nhieu JT, Feith J. Detection of Toxoplasma gondii by Competitive DNA Amplification of Bronchoalveolar Lavage Samples. JID 1993;168 (6): 1585-88.
8. Reishi U, Bretagne S, Kruger D, Ernault P, Costa JM: Comparison of two targets for the diagnosis of Toxoplasmosis by real-time PCR using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes. BMC Infect Dis. 2003; 3: 7 doi http://dx.doi.org/10.1186/1471-2334-37.
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