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BCaracterización histológica e inmunocitoquímica de la grasa infrapatelar de Hoffa
Edward Acero1-2, Luis Gustavo Celis2, Fernando Lizcano2, Jennifer Garay2 Juan Guillermo Ortiz3, German Carrillo4
1Facultad de Medicina, Universidad de La Sabana Grupo PROSEIM y Facultad de Medicina Universidad Militar. Grupo Morfología Médica.
2Facultad de Medicina, Universidad de La Sabana Grupo CIBUS.
3Clínica Universitaria de La Sabana.
4Fundación Santafé.
Correspondencia: luis.celis@unisabana.edu.co
Recibido: 03-11-2011 / Aceptado: 30-12-2011
El presente estudio tuvo como objetivo la caracterización histológica e inmunocitoquímica de la grasa infrapatelar de Hoffa (GIH) en 12 pacientes intervenidos por artroscopia, meningoplastia o remplazo de rodilla. Las fibras elásticas estuvieron presentes en la grasa infrapatelar con distribución unidireccional fascicular, se plantea una relación funcional en la biomecánicas del movimiento articular de la rodilla. Por otra parte las pruebas de inmunocitoquimica arrojaron marcaje positivo para vimentina, marcador de células del tejido conectivo; células mesenquimales y negativo para el resto de los anticuerpos estudiados.
Palabras clave: grasa infrapatelar, biomecánicas, vimentina, inmunocitoquimica, fibras elásticas.
Key words: infrapatellar fat, biomechanics, vimentin, immunohistochemical, elastic fibers.
El propósito del estudio fue el realizar una caracterización histológica e inmunocitoquímica de la grasa infrapatelar de Hoffa.
Consentimiento informado y toma de muestras
El consentimiento informado fue dado a conocer con antelación y aprobado por los pacientes que fueren intervenidos en la Clínica Universitaria de La Sabana y la Fundación Santafé.
A los pacientes se les extrajeron 1,5cm * 2,3cm cúbicos de grasa infrapatelar. Durante procedimientos de artroscopias, meningoplástias y reemplazos de rodilla.
Características de los pacientes y procesamiento de muestras
Las muestras extraídas se sumergieron en buffer de fosfato (PBS), se digirieron con colagenasa 0,5 % en PBS, a 37°C con agitación a 165 rpm por 30 minutos.
Luego se fijaron en formol al 10%, se sometieron a histotécnica en parafina, cortes de 3 micras fueron coloreados con hematoxilina –eosina. Se observaron al microscopio óptico marca AXIOTAR 34-F para análisis de la distribución y grosor de las fibras, se midieron 120 fibras con micrómetro de cámara digital marca MOTIC al recorrer 5 campos en 100 X.
Una fracción de la muestra digerida fue centrifugada a 250g por 10 minutos, posteriormente se le realizaron dos lavados con PBS separándose las células meseinquímales de los adipocitos maduros.
Fenotipificación inmunohistoquímica
Se realizó mediante un frotis directo en lámina porta objetos por cuadruplicado y se colorearon con azul de metileno para verificar su morfología, las 3 láminas restantes se realizaron con anticuerpos contra los filamentos intermedios de desmina, vimentina y citoqueratina y coloreados con diaminobencidina (Sigma, St. Luis) para su observación en el microscopio (Zeiss Imager A1, Alemania).
En la inmunofluorescencia se utilizó una lámina cubreobjetos con pozos delimitados por acrílico se dispusieron alícuotas de 20 microlitros de células de cultivo en medio F12. Se fijó la lámina luego con paraformaldehído al 4%, durante 10 minutos, lavando después con PBS dos veces durante 5 minutos. Luego se adicionó una solución al 0,1% de tritón X-100 y Solución Tampón Tris – TBS- a pH=7,6 durante 5 minutos y se lavó dos veces con la solución de TBS.
Se procedió después a incubar lámina durante 15 minutos con una solución de bloqueo al 5% de Suero Fetal Bovino y 0,001% de tritón X-100 en TBS. Luego de la incubación se añadió el anticuerpo monoclonal primario anti-vimentina (Dako, Glostrup, Denmark) diluido 1:100 en una solución de TBS al 0,001% de tritón X-100 y 5% de Suero Fetal Bovino, incubando toda la noche a 4ºC.
Al día siguiente se realizaron dos lavados con TBS, incubando a continuación con el anticuerpo secundario Alexa fluor 594 chicken anti-mouse IgG durante 45 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Una vez terminada la incubación se realizaron dos lavados con TBS y se procedió al montaje de los cubreobjetos en portaobjetos con medio acuoso Mowiol conteniendo colorante de Fluresceína marca Hoescht. Las láminas fueron observadas en un microscopio de fluoresencia (Nikon Eclipse 80i, Japón) con luz fluorescente, correspondiendo el marcaje de color verde intracelular como positivo a la presencia de vimentina.
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Figura 1. Histología de la Grasa Infrapatelar con coloración de H&E a 10 X. En 1A mostrando un estroma de tejido conectivo en medio de tejido adiposo unilocular y vasculatura arteriovenosa con 10x. En 1B mostrando la eosinofilia producto de la digestión enzimática con colagenasa en 10 X.
Postdigestión enzimática son reconocibles las fibras elásticas por su homogénea eosinofília y forma ondulalada o “senoide” en distribución de “unidireccionalidad” formando agregaciones de fibras elásticas de aspecto “fascícular” cuya ubicación sobresale entre el tejido conectivo denso irregular descrito predisgestión Figura 2A, en el extremo y bordes de la distribución “fascicular” elástica descrita, las fibras elásticas ramifican continuando con la matriz extracelular del tejido conectivo aerolar laxo periadiposo Figura 2B.
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Figura 2. Histología de la grasa infrapatelar en coloración de H&E postdigestión con colagenasa En 2A mostrando fascículos de fibras elásticas eosinófilas onduladas en 5X. En 2B a 10 X en el extremo fascicular mostrando ramificaciones de fibras elasticas esparcidas en distribución difusa.
Diámetro fibras elásticas
Tabla 1. Diámetro expresado en micras de las fibras elásticas intrafasciculares y perifasculares de la grasa infrapatelar
Por otra parte las pruebas de inmunocitoquimica e inmunofluoresencia arrojaron marcaje positivo para vimentina que es un marcador de tejido células del tejido conectivo como las células mesenquimales y adipocitos, y negativo para el resto de los anticuerpos estudiados, lo cual se corrobora con la morfología fibroblástica característica de estas células. En estos marcajes se pudo observar el grado de diferenciación de estas células, Figuras 3, 4 y 5.
Un cuidadoso estudio imagenológico funcional de Hamarneh et al con tomografía computarizada –CT- describe en la grasa infrapatelar cambios en los campos vectoriales al movimiento articular de extensión y flexión de la rodilla, adjudicando este hallazgo a un componente “elástico” de la grasa (14). Así mismo, Stevenson et al determina por imagenología CT y Resonancia Magnética –MRcambios graduales de la morfología de la grasa infrapatelar a diferentes ángulos de extensión y flexión de la rodilla, planteando la acomodación de la grasa infrapatelar a un componente “amortiguador elástico” (15).
En este estudio la particularidad de revelar fibras elásticas y por digestión con colagenasa demostrando además una distribución de unidireccional tipo “fascicular” permite adjudicar los cambios de forma de la grasa infrapatelar a los trabajos planteados por Hamarneh, et al (14) y Stevenson, et al (15) pues esta demostrado que los “fascículos” fibrosos elásticos juegan un rol funcional en la recuperación de la forma sin consumo energía luego de la deformación mecánica (16,17).
Figura 3. Células Mesenquimales derivadas de la Grasa Infrapatelar de Hoffa marcadas con anticuerpos contra vimentina y coloreadas con Diaminobencidina (DAB). Aumento 100X).
Figura 4. Células Mesenquimales derivadas de la Grasa Infrapatelar de Hoffa marcadas con anticuerpos con fluoresceína contra vimentina. (Aumento 100X).
Figura 5. Adipocitos de la Grasa Infrapatelar de Hoffa marcados con anticuerpos contra vimentina y coloreadas con Diaminobencidina (DAB). (Aumento 1000X).
En cuanto al grosor y distribución de las fibras se reporta en la literatura agrupamiento y engrosamiento con en relación a la exigencia de su actividad (18,19), en los conteos de fibras gruesas interfasciculares con promedio 5,56 micras y perifasciculares con grosores de 3,17 micras, Tabla 1. Llama la atención como las fibras perifasciculares mas delgadas se organizan en un patrón de distribución difuso esparciéndose entre la matriz extracelular adiposa, similar al característico patrón de distribución de fibras elasticas entre la matriz ósea que se halla en las entesis ligamentosas en los epicondilos del humero,(19) aspecto que podría correlacionar una distribución de fibras elasticas en la grasa infrapatelar con fines disipadores de tensión y acomodación de la superficie capsular sinovial al movimiento, similar al arreglo histológico de fibras colágenas y elasticas en la entesis del tendón de
Aquiles del modelo murino, (20).
Finalmente la fenotipicación demostró la presencia de células mesenquimales en el tejido adiposo graso de Hoffa, por lo que debemos resaltar la importancia de este tejido como fuente de células mesenquímales para ensayos de terapia celular en patologías de origen articular.
Este trabajo ha sido financiado por la Dirección de Investigación de la Universidad de La Sabana proyecto Med-96-2008.
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