Cultivos celulares como alternativa para el aislamiento y la producción de biológicos contra el Virus de Influenza
Luisa Fernanda Mancipe J, MV1, Gloria Ramírez N, Ph.D1, Jairo Jaime C, Ph.D1, Victor Vera A., Ph.D1
1Línea de Investigación en Microbiología y Epidemiología. Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.
Correspondencia: gcramirezn@unal.edu.co
Recibido: 06/09/2011 - Aceptado: 24/10/2011
El virus de influenza ha sido reconocido como un importante patógeno en poblaciones humanas y animales, ya que es el principal causante de enfermedades respiratorias. Muchas vacunas y aislamientos de virus de influenza humana y animal son realizadas actualmente en huevos embrionados, siendo este el método usado tradicionalmente por décadas. Sin embargo, se han encontrado inconvenientes en la elaboración de vacunas ya que el proceso de fabricación es de capacidad limitada (se requiere aproximadamente un huevo para generar una dosis vacunal) y alta demanda tiempo, disminuyendo su habilidad para generar biológicos rápidamente en el caso de una pandemia. El empleo de líneas celulares continuas para la producción de vacunas virales nace como alternativa que ofrece diversas ventajas: (i) oportunidad de emplear células completamente caracterizadas y estandarizadas, (ii) producción y planeación permanente de vacunas y (iii) los biológicos pueden ser producidos de forma más rápida.
El objetivo de esta revisión es analizar las diferentes alternativas empleadas en el cultivo y/o aislamiento de virus de influenza, enfatizando en el uso de cultivos celulares como sustrato para el aislamiento y la producción de biológicos destinados a la salud humana y animal.
Palabras clave: cultivos celulares, huevos embrionados, aislamiento, vacunas, virus de influenza.
Cell culture as an alternative for isolation and production of biologics against influenza virus
Influenza Virus has been recognized as an important pathogen in human and animal populations causing many respiratory diseases. Vaccine production and isolation of human and animal influenza viruses are made mainly in chicken embryo eggs, being the conventional method used for decades, however, several issues have been found for vaccine manufacture related with low efficiency of processes due to limited capacity of production (sometimes requiring one or two eggs to obtain a vaccine dose) and time spending that leads to decrease in the ability for fast vaccine production processes in a pandemic situation. The use of continuous cell lines for viral vaccine manufacture rises as a feasible choice offering several advantages including the opportunity to use fully characterized and standardized cells; in addition, cell-culture-derived vaccines don’t require further planning and vaccines can be produced rapidly.
The aim of this paper is to know different alternatives employed in culture and isolation of influenza viruses, emphasizing in the use of cell culture as a substrate for isolation and manufacture of vaccines for use in humans and animals.
Key words: cell cultures, chicken embryo eggs, isolation, vaccines, influenza virus.
Los virus de influenza tipo A se caracterizan por ser envueltos y pleomorficos. Su genoma esta constituido por RNA de polaridad negativa dividido en 8 segmentos que codifican para al menos once proteínas (2). Los segmentos 1, 2 y 3, codifican para el complejo polimerasa del virus, compuesto por 2 polimerasas basicas (PB1 y PB2) y una polimerasa acida (PA); los segmentos 4 y 6 codifican para las glicoproteínas de superficie hemaglutinina y neuraminidasa (HA y NA, respectivamente) las cuales constituyen los mayores antigenos virales; el segmento 5 codifica para la nucleoproteina (NP), la cual forma un complejo con el RNA viral. El segmento 7 codifica para dos proteinas las cuales comparten una region corta: la proteina de matriz M1 que le da estructura a la capside viral y la proteina de matriz M2 que funciona como un canal de intercambio ionico. Finalmente, el segmento 8 codifica para las proteinas NS1 (proteína no estructural) y NEP (NS2) que manejan el transporte, transcripcion y ensamble del RNA viral (1,3).
Los virus de influenza del genero A infectan una variedad de especies, incluyendo humanos, cerdos, caballos, mamiferos marinos y varias especies de aves. Estos virus se clasifican en subtipos basados en diferencias antigenicas entre sus dos glicoproteínas de superficie (HA y NA). Hasta la fecha se han identificado 16 subtipos de HA (H1-H16) y 9 subtipos de NA (N1-N9) (1,3).
El virus de Influenza es el ejemplo clásico de un virus geneticamente inestable, lo cual se relaciona basicamente con dos mecanismos que le permiten modificar su constitucion antigenica. El drift antigénico (acumulacion gradual de pequeñas mutaciones en los genes que codifican para la HA y/o la NA) confieren al virus la capacidad de evadir el sistema inmune del hospedero ya que dichos cambios pueden interferir con el reconocimiento apropiado por parte de anticuerpos generados por infecciones previas, favoreciendo de esta forma la diseminacion del virus (3,4). Un cambio mas drastico denominado shift antigénico, que consiste en el intercambio de segmentos completos de HA y/o NA entre dos subtipos diferentes de influenza que simultaneamente infectaron la misma celula, pueden dar origen a un nuevo virus que no había circulado antes en la poblacion humana y/o animal representando un riesgo potencial de infeccion con graves consecuencias en terminos de morbilidad y mortalidad (5,6). Cambios antigenicos de este o cualquier tipo, cumplen un papel determinante en el diseno de vacunas para el control de influenza, generando la busqueda de diferentes sustratos y ambientes que sean capaces de replicar eficientemente el virus para la elaboracion de biologicos de manera rapida y eficiente (7).
El desarrollo de biologicos contra influenza data de hace mas de 60 anos, cuando se prepararon vacunas inactivadas empleando como sustrato huevos embrionados de pollo (8). Aunque este método ha perdurado en el tiempo, presenta limitantes tales como una baja eficiencia y restriccion en la disponibilidad de cantidades apropiadas del biológico en un momento dado, ya que se requiere realizar una planeacion previa de 6 a 12 meses para asegurar que millones de huevos fertiles de alta calidad estén disponibles para su produccion. Otra limitante de dicho sustrato es que al realizar pasajes del virus en los huevos embrionados se puede alterar la estructura de la hemaglutinina (HA) generando un virus diferente a la cepa original, la respuesta inmune a la HA alterada no va a corresponder exactamente al virus circulante reduciendo la eficiencia de la vacuna contra influenza (9).
Con el fin de superar los inconvenientes mencionados anteriormente, se ha evaluado el empleo de líneas celulares continuas para la produccion de vacunas contra influenza. Ventajas tales como la disponibilidad de lineas celulares estandarizadas y caracterizadas que permiten una planeacion y produccion permanente como sustrato para la utilizacion en la fabricacion de vacunas, nace como opcion para la generacion eficaz y eficiente de biologicos contra influenza (8).
El proposito de esta revision es hacer un recorrido a traves del tiempo de las diferentes alternativas empleadas en el cultivo y/o aislamiento de virus de influenza, asi como llevar a cabo un analisis critico de la informacion disponible en relacion con el uso de los cultivos celulares como substrato para el aislamiento y la produccion de biologicos destinados principalmente a su uso en humanos y animales.
El proceso inicial de infeccion por virus de influenza es activado por la interaccion entre la hemaglutinina viral y los receptores relacionados con residuos de acido sialico (SA) presentes en las glicoproteinas de las celulas (10). Los receptores celulares de acido sialico presentan una conformacion particular: los residuos de SA estan unidos al penultimo grupo carbohidrato por enlaces del tipo α-2.3, α-2.6 o α-2.8 y muchas cepas de virus de influenza A se caracterizan por emplear los tipos α-2.3 y α-2.6 como receptor primario. In vivo, en humanos los virus de influenza se unen preferencialmente a enlaces de tipo SAα-2.6 presentes en el tracto respiratorio superior, mientras los virus de influenza aviar se unen a receptores SAα- 2.3 predominantes en el tracto digestivo de las aves (11,12). Por lo anterior la distribucion de ambos tipos de receptores, SAα-2.3 y SAα-2.6, en el epitelio traqueal del cerdo (13), soporta la hipotesis de que esta especie actua como un mezclador potencial de virus de influenza de origen humano y aviar.
Los virus de influenza A presentan propiedades de crecimiento In vitro, que dependen de la cepa y la preferencia de esta por el receptor celular que este presente en la celula blanco (14). Ademas la replicacion de los virus de influenza en la celula huesped depende de factores celulares como la activacion de las proteasas que clivan la HA inactiva (HA0) en HA1 y HA2, haciendo el virus infeccioso para las celulas susceptibles (15).
Las cepas del virus de influenza aisladas en líneas celulares se comportan de una manera similar en cuanto a su preferencia por unirse a ciertos receptores, es asi como virus provenientes de mamiferos se unen a enlaces de acido sialico en la penultima galactosa en la posicion α-2.6 (SA α-2.6 Gal) predominantes en la superficie de celulas respiratorias del tracto superior (16,17), mientras que los virus producidos en huevos embrionados se unen a los receptores que contienen SA α-2.3 Gal tipicos para especies aviares, debido a que las celulas epiteliales de la cavidad alantoica posee unicamente receptores de este tipo (8,18,19).
Por lo tanto, dentro de los aspectos a considerar para la eleccion del sustrato celular a emplear para cultivar un virus de influenza en particular, es indispensable garantizar que el sustrato empleado posea celulas con caracteristicas y receptores apropiados que favorezcan la replicacion viral.
En la busqueda de alternativas diferentes para el aislamiento y/o crecimiento de virus de influenza, la utilizacion de cultivos celulares como substrato en los sistemas de produccion de biologicos y procesos de aislamiento ofrece una buena alternativa comparado con el proceso realizado en huevos embrionados. El empleo de este tipo de procedimientos reduce los riesgos de contaminacion microbiologica y previene la presentacion de reacciones alergicas que podrían ser inducidas por la presencia, en el producto final, de componentes proteicos provenientes del huevo (20).
Es asi como el aislamiento y cultivo de virus de influenza se constituye en uno de los principales retos en los laboratorios de diagnostico y en los de la industria biofarmaceutica. Una alternativa la constituyen los cultivos primarios derivados de tejidos animales, dentro de los cuales se encuentran el cultivo primario de membranas corionicas fetales humanas (21), el de cerebro de rata (22), el de células de cerebro de embriones de raton (23), el cultivo primario de rinon y fibroblastos de embrion de pollo (24), el cultivo de celulas traqueales humanas (4) y el cultivo primario de celulas epiteliales respiratorias de cerdo (25), entre otros.
La principal ventaja de este tipo de cultivos es su capacidad de ofrecer una mayor sensibilidad porque brinda todas las condiciones necesarias cuando se utilizan para el crecimiento in vitro de virus, principalmente a las cepas que infectan la misma especie de la cual fueron obtenidos. Los cultivos primarios per se presentan desventajas tales como el riesgo de contaminacion con microorganismos adventicios, el alto costo de mantenimiento y suplementacion del medio de cultivo. Asi mismo, las tasas de recuperacion de particulas virales pueden ser menos eficientes comparadas con las de la línea celular continua, ademas de la dificil estandarización de procedimientos para algunos de estos cultivos (26).
Una alternativa para contrarrestar las limitantes inherentes a los cultivos primarios, la constituyen las lineas celulares establecidas. Este tipo de cultivo se caracteriza por presentar una vida media infinita, facilitar la generacion de clones, y adaptacion a condiciones de crecimiento en un medio de cultivo en particular, ademas de ofrecer la posibilidad de documentar facilmente su historial (8).
Especificamente en lo relacionado con el virus de influenza y en particular virus de influenza humana se han empleado para su cultivo lineas celulares tales como la Madin Darby Canine Kidney (MDCK) (6), las celulas embrionarias de retina humana (PER.C6) (27) y las celulas de rinon de mono verde Africano (VERO) (28), entre otras. En el caso de virus de influenza en cerdos por su parte se han empleado principalmente las lineas celulares MDCK (6), la linea celular epitelial intestinal de colon (CACO- 2) (29) y la linea celular de Rinon de Mono Verde Africano (VERO) (30).
En terminos generales se puede decir que tradicionalmente, se han empleado los huevos embrionados de pollo y los cultivos de células Madin Darby Canine Kidney (MDCK) para el aislamiento y propagacion del virus de influenza (31). Como se menciono anteriormente en el caso de las celulas epiteliales de la cavidad alantoica estas poseen unicamente receptores se acido sialico con enlaces α-2.3, mientras que las celulas MDCK poseen receptores con ambos tipos de enlaces α-2.3 y α-2.6 (19), permitiendo el crecimiento de un mayor espectro de cepas del virus de influenza A.
Actualmente se han publicado numerosos estudios que buscan determinar las caracteristicas y sustratos optimos para el crecimiento de virus de influenza a ser empleados en la produccion de biologicos. En un estudio realizado por Gambaryan et al. (16), se observo que el crecimiento de virus de influenza porcina H1N1 clasico en celulas MDCK, con previo crecimiento en huevos embrionados presenta afinidad por receptor con enlace de tipo SAα-2.6, pero no con receptores tipo SAα-2.3, encontrándose mayores tasa de replicacion viral en celulas MDCK (receptores de tipo SAα-2.6) y escasas sustituciones en los aminoacidos que componen la HA de los virus empleados en el estudio.
Teniendo en cuenta las ventajas comparativas que ofrecen las lineas celulares con respecto al sistema tradicional de elaboracion de vacunas contra el virus de influenza en huevos embrionados de pollo, las lineas celulares se han convertido, en un sistema alternativo viable y de eleccion para la producción de biologicos.
Por otra parte, se ha determinado que las moleculas de la HA de virus de influenza aislados en lineas celulares de mamiferos como la Madin Darby Canine Kidney (MDCK), Rhesus Monkey Kidney (LLC-MK-2), o celulas de rinon de mono verde africano (VERO) han sido antigenica y estructuralmente identicas a las cepas encontradas en muestras de pacientes (17), razon por la cual, el uso de las lineas celulares ha sido evaluado para su empleo en el aislamiento y produccion de vacunas contra el virus de influenza. Es necesario tener en cuenta varios factores en la seleccion de la línea celular destinada para la elaboracion de vacunas, principalmente el tipo de biologico a desarrollar, bien sea si se trata de vacunas inactivadas (virus completo, subunidades, facciones virales) o vacunas a virus vivo atenuado como en el caso de los virus adaptados a frio, ademas de la capacidad de la linea celular para generar altos titulos de virus de influenza necesarios para la elaboracion del biologico (32).
A continuacion se presenta una revision de los principales tipos de cultivo celular que han sido empleados en el crecimiento y/o aislamiento de virus de influenza y se discuten aspectos relacionados con los pros y los contras de su empleo como sustratos para la produccion de vacunas.
La linea celular MDCK (Madin Darby Canine Kidney) fue originalmente aislada en 1958 a partir del rinon de un perro adulto, aparentemente normal, de raza Cocker Spaniel, la cual fue subsecuentemente depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) y se designo como CCL34 (registro de lineas celulares animales, 1965). A partir de 1975, el cultivo de celulas MDCK comenzo a ser ampliamente utilizado para el aislamiento de virus de influenza A y gracias a esto, es rutinariamente empleado en programas de vigilancia en salud publica, virología clinica y en laboratorios de investigacion en todo el mundo por servir como un sustrato para el cultivo de virus de influenza mostrando una buena sensibilidad y permitiendo el crecimiento de un amplio rango de diferentes cepas del virus (33,34).
En cuanto a su utilizacion en la producción comercial de vacunas, la linea celular MDCK ha sido empleada en la produccion de vacunas inactivadas de influenza en Europa y para investigaciones clínicas en los Estados Unidos (33) Figura 1.
Una preocupacion en la elaboracion de vacunas derivadas de cultivos celulares es el potencial de formacion de tumores por los residuos de la línea celular empleada, lo cual genera la necesidad de caracterizar los componentes celulares residuales que puedan quedar en el biologico, ademas de establecer la presencia de agentes adventicios y/o elementos con propiedades oncogenicas que representen un riesgo en el individuo receptor de la vacuna. Liu J. et al. (34), evaluaron el riesgo potencial de la línea celular MDCK de generar residuos en el sobrenadante del cultivo que puedan ocasionar la formacion de tumores. Para esto emplearon un clon de las células MDCK (9B9-1E4) en dos modelos animales (ratones adultos y ratones recien nacidos).
Figura 1. Linea Celular MDCK pase 16, aumento de 10X .
Encontrando que de 347 animales que fueron inyectados con varias dosis del lisado de celulas MDCK (>107 celulas) solamente un animal desarrollo un sarcoma histiocitico, el cual no estuvo asociado a la aplicacion del lisado de celulas, ya que no se encontro DNA de las celulas MDCK en el tumor, ni concordo con la tasa de eventos de presentacion de tumores observada entre los animales inyectados y el control negativo (tratados con PBS).
Este esudio asi como otros reportes indican que las celulas MDCK no inducen la formacion de tumores a bajas dosis (<105 celulas) (35) presentando un bajo potencial oncogenico, con alta tasa de replicacion del virus, caracteristicas que hacen de este sustrato ideal para la produccion de biologicos (34).
La Linea Celular Vero (Linea celular de Rinon de Mono Verde Africano) fue establecida en 1962 por Yasumara y Kawakita a partir del rinon de un mono verde africano normal. En la actualidad, la linea celular es distribuida por la American Type Culture Collection (ATCC) en pasaje 124 bajo la designacion de ATCC CCL 81 (36). La Linea de celulas VERO es susceptible a un amplio rango de virus, siendo empleada para la fabricacion de vacunas de poliomielitis y rabia en humanos (36), Asi mismo, diferentes reportes han demostrado que este sustrato es apropiado para el aislamiento y la replicacion productiva de virus de influenza A y B por los altos titulos infectivos que genera, manteniendo las caracteristicas de la HA de los virus de influenza empleados en este sustrato (30).
Una limitante en el uso de las celulas VERO para el crecimiento del virus de influenza se relaciona con el hecho de que estas celulas inactivan rápidamente la tripsina exogena restringiendo asi la replicación de los virus de influenza ya que la HA no puede ser clivada eficientemente (30). Sin embargo, dicha limitante puede ser superada mediante la adicion repetida de tripsina al medio de cultivo lo cual mejora la replicacion y multiplicacion del virus de influenza tipo A (37).
En cuanto a las vacunas de influenza derivadas de celulas VERO, estas han sido producidas y evaluadas por la generacion de inmunogencidad y su produccion ha sido escalada a niveles comerciales.
Dichos biologicos inducen una respuesta humoral comparable a los biologicos producidos en huevos embrionados, siendo ademas, potentes estimulantes de la respuesta celular (38). En un estudio realizado por Bruhl et al., (39), compararon una vacuna trivalente de virus inactivado producida en células VERO con una vacuna producida en huevos embrionados, determinando la respuesta humoral y celular contra Influenza en ratones Balb/c, reportan que en todos los grupos de ratones inmunizados con los dos biologicos huborespuesta de anticuerpos IgG de tipo IgG1 e IgG2a/2b. En cuanto a la respuesta de celulas T, IL-2 y INF-γ (Linfocitos T ayudadores o Th1) fueron producidos de forma significativa en los ratones que fueron inmunizados con la vacuna fabricada en celulas VERO; cabe destacar que la respuesta de tipo Th1 es la responsable de la estimulacion de los linfocitos T citotoxicos requeridos para la eliminacion de virus de influenza en el tejido pulmonar infectado (39).
Al comparar la eficiencia de las celulas MDCK y VERO en la replicacion del virus de influenza Youil, R. et al., (28) determinaron que ambas lineas celulares son capaces de replicar el virus produciendo cargas virales maximas de 10-11 log10 copias de genoma/ml.
Sin embargo, las celulas MDCK generan cargas virales 2 a 3 veces mas altas que las celulas VERO a las 24 y 48 horas postinfeccion; dichos resultados indican una mayor eficiencia en la replicacion del virus en células MDCK frente a las celulas VERO, lo cual hace de las celulas MDCK un sustrato de eleccion para el aislamiento y crecimiento del virus de influenza.
La Linea Celular HEK-293 (celulas de rinon de embrion humano 293) Ha sido ampliamente empleada por la comunidad cientifica por mas de 30 anos como una plataforma eficiente para la produccion a gran escala de proteinas recombinantes y vectores virales (20). Esta linea celular tiene como ventaja su facil crecimiento en un cultivo en suspension a altas densidades celulares (107 celulas/ ml en tipo batch) y en medio libre de suero (20).
En el caso particular del uso de la linea celular HEK- 293 para la produccion de vacunas contra el virus de Influenza, Le Ru A. et al. (20), evaluaron su uso como una alternativa eficiente para el escalamiento en la produccion de virus de influenza empleando para este fin las cepas A/PR/8/34 (H1N1), A/WS/33 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/Hong Kong/8/68 (H3N2) y la B/Lee/40. Dentro de los parametros evaluados se determino la presencia de receptores α-2.3 y α-2.6 en la superficie de las celulas HEK-293, realizando simultaneamente la deteccion de dichos receptores en celulas MDCK. Para evaluar la propagacion del virus de influenza en celulas HEK-293 se empleo la tecnica de inmunofluorescencia, a traves de la cual, en el caso de la cepa A/PR/8/34 (H1N1) se determino replicacion del virus a las 24 horas post-infeccion. El numero de particulas infectivas aumento a las 48 hpi, mientras la viabilidad celular permanecio alta (>80%), observandose efecto citopatico caracteristico de células infectadas por virus de influenza a las 72 y 96 hpi.
Los autores senalan que las celulas de la linea HEK- 293 presentan ventajas tales como un crecimiento rapido en suspension en un medio de cultivo libre de suero, son capaces de producir altos titulos de virus infecciosos de influenza para los diferentes subtipos (A/H1, A/H3 y B) sin requerir adaptaciones previas, generando particulas virales con las caracteristicas de los virus de influenza (20).
Sin embargo, al comparar la eficiencia de repliacion de virus de influenza en la linea celular HEK-293 frente a la linea MDCK, se encontro que las celulas HEK-293 presentan un rendimiento mas bajo principalmente en los primeros pasajes del virus en el cultivo celular.
La Linea Celular CACO-2 (adenocarcinoma de colon humano) tiene como caracteristica distintiva que no requiere de la adicion de tripsina al medio de cultivo debido a que contiene las proteasas necesarias para el clivaje de la HA, facilitando asi el ingreso del virus de influenza a la celula y la observacion del efecto citopatico (40, 29). La linea celular de epitelio intestinal de colon (CACO-2) ha mostrado mayor eficiencia en el aislamiento de virus de influenza del tipo A H3N2 y H1N1 en muestras clínicas provenientes de humanos comparado con la línea MDCK o los huevos embrionados (40). Las células Caco-2 contienen receptores de acido sialico de tipo α-2.3 (preferencialmente para virus de influenza aviar) y α-2.6 (preferencialmente para virus de influenza humana (31,40). Asi mismo Jahangir et al. (41) reporta que las celulas CACO-2 son permisivas al virus de influenza aviar de baja patogenicidad, indicando que dicha sensibilidad es similar a la encontrada en huevos embrionados.
Con el fin de determinar el comportamiento de diferentes substratos para el aislamiento de virus de influenza en cerdos, Chiapponi, C. et al. (29), realizaron un estudio en el que se evaluo la eficiencia de las lineas celulares CACO-2, MDCK y la inoculación en huevos embrionados para el aislamiento de virus de influenza porcina A H1N1, H1N2 y H3N2 a partir de muestras clinicas. Se obtuvieron resultados que variaron de acuerdo a los diferentes subtipos en relacion con los sustratos evaluados. Es asi como el 100% de los virus de los subtipos H1N1 y H1N2 fueron aislados en celulas CACO-2, mientras que en el mismo sustrato solo el 50% de los virus del subtipo H3N2 fue aislado. Esto contrasta con los resultados encontrados en la inoculacion en huevos embrionados, donde se aislo con mayor frecuencia virus del subtipo H3N2, mientras que solo el 44% del virus H1N1 y el 11% del virus H1N2 fueron aislados en este sustrato. Por su parte, los resultados de la inoculacion de los mismo subtipos en celulas MDCK, mostraron que el porcentaje de aislamientos positivos fue del 56% para el subtipo H1N1, del 3.5% para el subtipo H1N2 y del 38% para el subtipo H3N2.
Los resultados obtenidos en ese estudio, sugieren que existe una fuerte asociacion entre la cepa del virus y el tropismo celular. Aunque el sustrato que presento mayor eficiencia en el aislamiento viral para los subtipos H1N1 y H1N2 fue la linea celular CACO- 2, comparada con las celulas MDCK y los huevos embrionados. Sin embargo, la deteccion del subtipo H3N2 fue mucho mas alta en huevos embrionados.
Con base en lo anterior se sugiere que para lograr detectar los tres subtipos del virus involucrados en la presentacion de influenza porcina, es necesario emplear simultaneamente los dos sustratos (células CACO-2 y huevos embrionados) (29,40).
Otros tipos de lineas celulares tales como las lineas MRC-5, WI-38, FrhL, se han empleado igualmente para la replicacion de virus de influenza con el fin de utilizarlos en la fabricacion de vacunas.
La linea MRC-5 (Medical Research Council 5) es de origen de fibroblastos de pulmon humano provenientes de un feto masculino de 14 semanas; en la ATCC tiene registro numero CCL-171. Esta linea celular fue preparada y desarrollada por J. P. Jacobs en 1966. Es empleada principalmente para la replicacion y elaboracion de vacunas de influenza humana debido a que estas celulas presentan receptores de tipo SAα2-6, sin embargo, presentan como desventaja su baja sensibilidad (57,1%) a virus de influenza humana cuando se compara con las celulas MDCK (100% de sensibilidad), lo cual hace que su uso sea de baja eleccion para la replicación de dicho virus (35,41). La linea WI-38 (Winstar Institute 38) es de origen de fibroblastos diploides de pulmon humano, derivados de un feto femenino. Fue preparada y desarrollada por Leonard Hayflick en 1964, tiene registro ATCC numero CCL-75.
Esta linea celular ha sido usada para la preparación de la vacuna RA 27/3 contra la rubeola. En cuanto al virus de influenza se ha demostrado que genera altas tasas de replicacion viral (21), sin embargo una vida media limitada es su principal desventaja.
La linea FrhL con registro ATCC-CCL160, es de origen de fibroblastos de pulmon de un feto de mono hembra Rhesus. Esta es una linea celular diploide que ha sido utilizada para la replicación de virus de influenza porque produce titulos altos de virus y ha sido recomendada para la producción de vacunas comerciales. Al igual que la anterior, esta linea celular presenta como limitante una vida media limitada ya que al estar compuesta por células diploides limita su utilizacion como sustrato para la produccion de biologicos por su manejo dispendioso y bajo rendimiento a gran escala (6).
Tabla 1. Lineas celulares de origen humano susceptibles a Virus de Influenza A
Al comparar la eficiencia de las lineas celulares MRC-5, WI-38, FRhL, VERO y MDCK como sustratos para la produccion de vacunas vivas atenuadas de influenza Liu, J. et al., (34) encontraron que las celulas MRC-5, WI-38 y FRhL no produjeron titulos suficientemente altos de varios subtipos de virus los cuales son necesarios para la produccion del biologico. En el caso de las celulas VERO se considera que estas producen titulos altos para un numero limitado de dichos subtipos y requieren de altas cantidades de suero fetal bovino, lo cual limita el crecimiento de las cepas vacunales, haciendo de esta linea celular un sustrato de baja eleccion para la produccion de vacunas vivas atenuadas de influenza. En contraste, las celulas MDCK son capaces de producir títulos altos de cepas vacunales vivas atenuadas para un amplio rango de subtipos y variantes de cepas de virus de influenza estacional A/H1, A/H3 y de influenza B (16,18).
A traves del tiempo, se han estudiado diversas lineas celulares originadas de diferentes órganos y especies para poder establecer la susceptibilidad de dichos sustratos a diferentes virus de influenza.
En la Tabla 1 se presentan algunas lineas celulares susceptibles a virus de influenza. Dentro de los sustratos originados de humanos, se encuentra una amplia variedad de cultivos celulares que han respondido de forma diferente en cuanto a la tasa de replicacion viral, Tabla 1.
En cuanto a lineas celulares de origen animal que son susceptibles al virus de influenza se encuentra un numero mas limitado de sustratos provenientes de diversos origenes y especies tales como los primates no humanos, cerdos y caninos, Tabla 2. Con el fin de comparar la susceptibilidad al virus de influenza en diferentes lineas celulares de origen humano y animal, IWS Li et al., (32) emplearon los virus A/HK/415742/09 (H1N1) de origen porcino, A/HK/403946/09 (H1N1) estacional humano y H5N1 A/Vietnam/1194/04 de origen aviar para determinar y comparar su replicacion en diferentes substratos.
Tabla2. Lineas Celulares de Origen Animal Susceptibles a Virus de Influenza A
En el caso de la cepa H5N1 se encontro que dicho virus fue capaz de replicarse en todas las líneas celulares, a excepcion de las celulas Hep-2. Las cepas H1N1 de origen humano y H1N1 de origen porcino fueron capaces de replicarse en lineas celulares derivadas del tracto respiratorio inferior, tracto gastrointestinal, higado, rinon y musculo.
Con respecto a las lineas celulares de origen animal, la replicacion fue detectada en todas las lineas celulares (mono, perro, cerdo). La cepa H5N1 mostro mayor eficiencia de replicacion comparada con los virus H1N1 de origen humano y porcino.
En cuanto a susceptibilidad de las lineas celulares de origen animal se determinó que los sustratos que son más sensibles a los tres subtipos de virus de influenza son la linea celular MDCK, BSC-1 y PK-15 (32).
De la misma forma, se ha podido determinar que los virus de influenza de origen humano, porcino y aviar tienen una amplia variedad de lineas celulares para su replicacion, pero se ha encontrado que pocos sustratos entre los cuales estan los derivados del tracto respiratorio inferior, algunas lineas del tracto gastrointestinal y en el caso de las lineas de origen animal la linea celular MDCK, son capaces de hacerlo eficientemente. (42,32).
La plataforma de produccion de vacunas basadas en cultivos celulares, permite la extension a gran escala siempre y cuando las celulas se manejen en suspension.
Un sistema similar de produccion es necesario en el caso de aparicion de epidemias o pandemias. Como ejemplo estan las vacunas producidas en cultivos celulares de virus de rabia, poliovirus y rotavirus fabricados en celulas VERO (43).
Asi mismo, se ha determinado que el uso de células en suspension simplifica los procesos de producción de vacunas en forma escalable, debido a que las superficies de crecimiento de las celulas como los microportadores no requieren anclaje y tampoco de procesos como desprendimiento de las celulas entre cada pasaje celular. Una ventaja adicional del uso de cultivos en suspension es que permite el uso de medios quimicos definidos, los cuales no requieren suplementacion con suero fetal bovino lo cual elimina riesgos potenciales del uso de dicho suero como son la variacion entre lotes y el riesgo potencial de contaminacion con mycoplasma, virus o priones (44); reduciendo ademas los costos de produccion.
Como se ha mencionado previamente, las células MDCK presentan caracteristicas de sustrato ideal para la replicacion de virus de influenza, pero su rapida expansion en cultivo es dificil debido a su crecimiento dependiente de anclaje (43). Chu et al., (43) generaron celulas MDCK que fueran capaces de crecer en suspension mediante la transfeccion del gen humano sialiltransferasa (siat7e) que disminuye la adhesion celular. Para determinar la susceptibilidad de esta nueva linea celular (MDCK-siat7e) y la produccion escalable de virus, se emplearon en el estudio 4 virus vacunales (A/California/07/2009 X-179A H1N1, A/Brisbane/59/2007 IVR-148 H1N1, A/Uruguay/716/2007 X-175C H3N2, y B/ Brisbane/60/2008). Se determinó que la linea celular MDCK-siat7e fue capaz de replicar las cuatro cepas, generando titulos hemaglutinantes de 1:512; un inconveniente es que la progenie de virus colectada despues de pasajes seriales exhibieron mutaciones minimas en el gen que codifica para la proteina HA. Sin embargo, este proceso ofrece perspectivas para la implementacion de cultivos en suspension con células MDCK para el crecimiento de virus de influenza a ser utilizados en la elaboracion de vacunas (44-49).
Como desventajas del crecimiento de células MDCK en suspension, se ha determinado que estas celulas pueden formar quistes multicelulares que generan polarizacion de las membranas celulares disminuyendo el porcentaje de replicacion celular de 1-4%. Ademas, presentan disminucion en la agregacion celular seguido de una baja viabilidad que va a inducir a la apoptosis celular (44). Se determinó igualmente que las celulas MDCK- siat7e presentan escape de aniones cuando crecen en suspensión sugiriendo que estas celulas puedan volverse tumorogenicas como resultado de la modificación de la actividad de la enzima sialiltransferasa (50-53).
Aunque existe el riesgo de tumorogenicidad y a pesar de las desventajas que pueden presentar los cultivos en suspension, se estan llevando a cabo diversos estudios que buscan superar estos inconvenientes, ya que para lograr la producción de biologicos a partir de cultivos celulares a nivel industrial se hace necesario establecer lineas celulares en suspension que facilitan y agilizan el escalamiento de los procesos en la elaboracion de vacunas que optimicen tiempo, costos y la rapida reaccion frente a la presentacion de epidemias o pandemias (54-58).
Estas condiciones estan asociadas con la preferencia por el receptor celular, que los virus de influenza A requieren para inducir infeccion. A pesar de que la inoculacion en huevos embrionados de pollo es el sistema biologico de eleccion para el aislamiento y crecimiento de virus de influenza, este sustrato presenta como principal inconveniente una dificil disponibilidad oportuna en cantidades suficientes para la produccion de virus que va a ser utilizado en la produccion de vacunas, particularmente en el caso de epidemias o pandemias, ademas del riesgo de generar variaciones en la secuencia de la hemaglutinina (HA), debido a un proceso de adaptacion del virus al crecimiento en este tipo de substrato. Debido a las limitantes conocidas acerca del uso de los huevos embrionados para la fabricacion de vacunas contra influenza, se han evaluado diversas lineas celulares que ofrecen ventajas sobre los huevos embrionados, entre las cuales se destacan la facilidad de emplear células completamente caracterizadas y estandarizadas, mayor capacidad y rapidez de produccion de biologicos en el caso de la aparicion de una nueva cepa de virus (pandemia) y menor riesgo de cambio en las propiedades de union al receptor de la HA.
La generacion de vacunas a partir de cultivos celulares es una excelente alternativa que nace de la necesidad de producir en corto tiempo biológicos seguros que no generen reacciones indeseadas en la poblacion y principalmente que controlen la presentacion y diseminacion de la enfermedad a nivel mundial, ya que la poblacion humana y animal se han visto seriamente afectados por el comportamiento cambiante e impredecible del virus de influenza; de esta forma, los cultivos celulares abren un sinnúmero de posibilidades para la industria dedicada a la generacion de biologicos.
2. Flint, S.J. Principles of Virology: molecular biology, pathogenesis and control of animal viruses. 2nd ed. Washington, USA. 2004. p. 918.
3. Gramer M. An update on swine influenza ecology and diagnostics. American Association of Swine Veterinarians, 2008.
4. Reemers S, Koerkamp M, Holstege F, Eden W, Vervelde L. Cellular host transcriptional responses to influenza A virus in chicken tracheal organ cultures differ from responses in in vivo infected trachea. Veterinary Immunology and Immunopathology 132 (2009) 91–100
5. Reeth VK, Vleeschauwer A, Kyriakis C, Pensaert M. Influenza in Birds, Pigs and Humans: Old Theories versus Current Viewpoints. Proceedings of the 19th IPVS congress, Copenhagen, Denmark, 2006. Volume 1.
6. Voeten JTM, Brands R, Palache AM, van Scharrenburg GJM, Rimmelzwaan GF, Osterhaus ADME, et al. Characterization of high-growth reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-free medium. Vaccine 1999;17:1942–50
7. Couch RB. Seasonal inactivated influenza virus vaccines. Vaccine 26s (2008) D5 – D9
8. Tree JA, Richardson C, Fooks AR, Clegg JC, Looby D. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains. Vaccine 19 (2001) 3444–3450
9. Robertson JS, Bootman JS, Newman R, et al. Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A(H1N1) virus. Virology 1987; 160:31–7.
10. Chu VC, Whittaker GR. Influenza virus entry and infection require host cell N-linked glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (52), 2004; 18153–18158.
11. Rogers GN & D’Souza BL. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology 173, 1989; 317–322.
12. Rogers GN & Paulson JC. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology 127, 1983; 361–373.
13. Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virology 72. 1998; 7367–7373.
14. Lee CW, Jung K, Jadhao SJ, Suarez DL. Evaluation of chicken-origin (DF-1) and quail-origin (QT-6) fibroblast cell lines for replication of avian influenza viruses. J. Virol. Methods 153, 2008; 22–28.
15. Steinhauer DA. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology 258, 1999; 1–20.
16. Gambaryan AS, Karasin AI, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, et al. Receptor binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells. Virus Res. 2005; 114 (1–2), 15–22.
17. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Voglauer R, Mochalova L, Bovin N, et al. Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vero and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology 307 (2003) 90–97
18. Gambaryan AS, Marinina VP, Tuzikov AB, Bovin NV, Rudneva IA, Sinitsyn BV, et al. Effects of host dependent glycosylation of hemagglutinin on receptor-binding properties on H1N1 human influenza A virus grown in MDCK cells and in embryonated eggs. Virology 247. 1998; 170–177
19. Ito T, Suzuki Y, Takada A, Kawamoto A, Otsuki K, Masuda H, et al. Differences in sialic acid–galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virology 71, 1997; 3357–3362.
20. Le Ru A, Jacob D, Transfiguracion J, Ansorge S, Henry O, Kamen AA. Scalable production of influenza virus in HEK-293 cells for efficient vaccine Manufacturing. Vaccine 28 (2010) 3661–3671
21. Uchide N, Suzuki A, Ohyama K, Bessho T, Toyoda H. Secretion of Bioactive Interleukin-6 and Tumor Necrosis Factor-α Proteins from Primary Cultured Human Fetal Membrane Chorion Cells Infected with Influenza Virus . Placenta, Volume 27, Issues 6-7, June-July 2006, Pages 678-690
22. Takahashi M, Yamada T, Nakanishis K, Fujitas K, Nakajima’i K, Nobusawa E, et al. Influenza A Virus Infection of Primary Cultured Cells From Rat Fetal Brain. Parkingsonism & Related Disorders. Vol. 3, No. 2, pp 97 – 102, 1997
23. Bradshaw GL, Schwartz CD, Schlesinger RW. Replication of H1N1 influenza viruses in cultured mouse embryo brain cells: Virus strain and cell differentiation affect synthesis of proteins encoded in RNA segments 7 and 8 and efficiency of mRNA splicing Virology, Volume 176, Issue 2, June 1990, Pages 390-402
24. Tannock GA, Bryce DA, Paul JA. Evaluation of chicken kidney and chicken embryo kidney cultures for the large-scale growth of attenuated influenza virus master strain A/Ann/Arbor/6/60-ca. Vaccine, Volume 3, Issue 4, September 1985, Pages 333-339
25. Busch MG, Bateman AC, Landolt GA, Karasin AI, Brockman-Schneider RA, Gern JE, et al. Identification of amino acids in the HA of H3 influenza viruses that determine infectivity levels in primary swine respiratory epithelial cells . Virus Research, Volume 133, Issue 2, May 2008, Pages 269-279
26. Initiative for Vaccine Research World Health Organization. Use of Cell Lines for the Production of Influenza Virus Vaccines: An Appraisal of Technical, manufacturing, and Regulatory Considerations Geneva, Switzerland, 10 April 2007
27. Pau MG, Ophorst C, Koldijk MH, Schouten G, Mehtali M, Uytdehaag F. The human cell line PER.C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines. Vaccine 2001; 19:2716–21.
28. Youil R, Su Q, Toner TJ, Szymkowiak C, Kwan WS, Rubin B, et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J Virol Methods 2004; 120:23–31.
29. Chiapponi C, Zanni I, Garbarino C, Barigazzi G, Foni E. Comparison of the usefulness of the CACO-2 cell line with standard substrates for isolation of swine influenza A viruses. Journal of Virological Methods 163 (2010) 162–165
30. Govorkova EA, Murk G, Meignier B, De Taisne C. and Webster RG. African Green Monkey Kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for Influenza A and B virus. J. Viral. 1996, 70, 5519 5524.
31. Takemae N, Ruttanapumma R, Parchariyanon S, Yoneyama S, Hayashi T, Hiramatsu H, et al. Animal cell culture in pharmaceutical biotechnology: research and perspectives. Revista Mexicana de Ciencias Farmaceuticas. Volumen 40, Numero 4 , Octubre - Diciembre 2009
32. I.W.S. Li, K.H. Chan, K.W.K. To, S.S.Y. Wong, P.L. Ho, S.K.P. Lau, et al. Differential susceptibility of different cell lines to swine-origin influenza A H1N1, seasonal human influenza A H1N1, and avian influenza A H5N1 viruses. Journal of Clinical Virology 46 (2009) 325–330
33. Clavijo A, Tresnan DB, Jolie R, Zhou EM. Comparison of embryonated chicken eggs with MDCK cell culture for the isolation of swine influenza virus. The Canadian Journal of Veterinary Research. 2002; 66:117.121
34. Liu J, Mani S, Schwartz R, Richman L, Tabor DE. Cloning and assessment of tumorigenicity and oncogenicity of a Madin–Darby canine kidney (MDCK) cell line for influenza vaccine production. Vaccine 28 (2010) 1285–1293
35. Medema JK, Meijer J, Kersten AJ, Horton R. Safety assessment of Madin Darby canine kidney cells as vaccine substrate. Dev Biol (Basel) 2006; 123:243–50[discussion 65–6].
36. Kistner O, Barrett PN, Mundt W, Reiter M, Schober-Bendixen S, and Darner F. Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate influenza virus vaccine. Vaccine 1998 Volume 16 Number 9/l 0
37. Ozaki H, Govorkova EA, Li C, Xiong X, Webster RG, and Webby RJ. Generation of High-Yielding Influenza A Viruses in African Green Monkey Kidney (Vero) Cells by Reverse Genetics. Journal of Virology, Feb. 2004, p. 1851–1857
38. Oxford JS, Corcoran T, Knott R, et al. Serological studies with influenza A(H1N1) viruses cultivated in eggs or in a canine kidney cell line (MDCK). Bull World Health Organ 1987; 65:181–7.
39. Bruhl P, Kerschbaum A, Kistner O, Barrett N, Dorner F, Gerencer M. Humoral and cell-mediated immunity to Vero cell-derived influenza vaccine. Vaccine 19 (2001) 1149–1158
40. Zhirnov OP and Klenk HD. Human influenza A viruses are proteolytically acti- vated and do not induce apoptosis in Caco-2 cells. Virology 313, 2003; 198–212.
41. Arbelaez G, Calderon D, Rincon M, Lora A, Mercado M. Implementacion de dos metodologias diagnosticas para la determinacion del virus de influenza porcina. Universitas Scientiarum, Revista de la Facultad de Ciencias Vol. 13 N° 1, 65-74. Enero-Junio 2008
42. Garcia-Sastre A, Durbin RK, Zheng H, Palese P, Gertner R, Levy DE, et al. The role of interferon in influenza virus tissue tropism. J Virol 1998; 72:8550–8.
43. Chu C, Lugovtsev V, Lewis A, Betenbaugh M, Shiloach J. Production and antigenic properties of influenza virus from suspension MDCK-siat7e cells in a bench-scale bioreactor. Vaccine 28 (2010) 7193–7201.
44. Wielink R. van, Kant-Eenbergen HCM, Harmsen MM, Martens DE, Wijffels RH, Coco-Martin JM. Adaptation of a Madin–Darby canine kidney cell line to suspension growth in serum-free media and comparison of its ability to produce avian influenza virus to Vero and BHK21 cell lines. Journal of Virological Methods 171 (2011) 53–60
45. Bardiya N, Bae JH. Influenza vaccines: recent advances in production technologies. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 67: 299–305.
46. Belsey M, Evans D, Pavlou A, Savopoulos J. Growth drivers and resistors of the influenza market: The importance of cell culture flu. J Commercial Biotechnol 2005;12 (2):150–5.
47. Groth N, Montomoli E, Gentile C, Manini I, Bugarini R, Podda A. Safety, tolerability and immunogenicity of a mammalian cell-culturederived influenza vaccine: A sequential Phase I and Phase II clinical trial. Vaccine 27 (2009) 786–791
48. Katz J M, Naeve CW & Webster RG. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses. Virology 156, 1987; 386–395.
49. Liu Jonathan, Shi X, Schwartz R, Kemble G. Use of MDCK cells for production of live attenuated influenza vaccine. Vaccine 27 (2009) 6460–6463
50. Maines TR, Jayaraman A, Belser JA, Wadford DA, Pappas C, Zeng H, et al. Transmission and pathogenesis of swine-origin 2009 A (H1N1) influenza viruses in ferrets and mice. Science 2009; 325:484–7.
51. Mochalova L, Gambaryan A, Romanova J, Tuzikov A, Chinarev A, Katinger D, et al. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs. Virology 313 (2003) 473–480
52. Naffakh N, Van der Wef S. April 2009: an outbreak of swine-origin influenza A(H1N1) virus with evidence for human to human transmission. Microbes and Infection 11 (2009) 725-728.
53. Nicholson KG, Wood JM, Zambon M. Influenza. The Lancet. Vol 362 November 22, 2003
54. Robertson JS, Cook P, Attwell AM, et al. Replicative advantage in tissue culture of egg-adapted influenza virus over tissue-culture derived virus: implications for vaccine manufacture. Vaccine 1995; 13:1583–8.
55. Saito T. Alterations in receptor-binding properties of swine influenza viruses of the H1 subtype after isolation in embryonated chicken eggs. Journal of General Virology (2010), 91, 938–948
56. Takemae N, Ruttanapumma R, Parchariyanon S, Yoneyama S, Hayashi T, Hiramatsu H, et al. Alterations in receptor-binding properties of swine influenza viruses of the H1 subtype after isolation in embryonated chicken eggs. Journal of General Virology (2010), 91, 938–948
57. Yewdell J and Garcia-Sastre A. Influenza virus still surprises. Current Opinion in Microbiology 2002, 5:414–418
58. Zhirnov OP, Vorobjeva IV, Saphonova OA, Malyshev NA, Ovcharenko AV, Klenk HD. Specific biochemical features of replication of clinical influenza viruses in human intestinal cell culture. Biochemistry (Mosc.) 72, 2007; 398–408.