Biotransformación de metales pesados presentes en lodos ribereños de los ríos Bogotá y Tunjuelo
Catherine Soto1, Sonia Gutiérrez1, Alexandra Rey-León1, Edwin González-Rojas1
1Grupo de Investigación GRESIA, Universidad Antonio Nariño
Correspondencia: edwigonzalez@uan.edu.co
Recibido: 16-07-10 / Aceptado: 02-12-10
La presencia de metales pesados en los lodos ribereños de la zona media de los ríos Bogotá y Tunjuelo, procedentes de desechos de industriales, ha influenciado y permeado la calidad de los suelos en la Sabana de Bogotá. Esto se refleja en las pequeñas concentraciones presentes en vegetales que se utilizan para la alimentación humana, causando efectos nocivos para la salud. La biotransformación de estos metales es posible gracias a la presencia de algunas moléculas inorgánicas y de microorganismos capaces de interactuar, cambiando su biodisponibilidad en el medio. Esta investigación determinó la concentración de cromo, plomo y mercurio en la zona media de los ríos Bogotá y Tunjuelo, mediante la técnica de absorción atómica.
Los microorganismos se encuentran expuestos a la presencia de metales pesados, lo cual selecciona variantes capaces de tolerar sus efectos nocivos. El estudio de estas interacciones, con sus mecanismos de tolerancia, expone el potencial de éstos para ser utilizados en procesos biotecnológicos como la biorremediación de la contaminación ambiental por metales pesados. Mediante experimentos de laboratorio, se logró extraer cepas por cultivo directo y enriquecimiento selectivo y determinar su grado de compromiso en la biotransfomación y biodisponibilidad de metales como cromo, plomo y mercurio, concluyendo que uno de los géneros más comprometidos es el Micrococos, seguido por Pseudomonas.
Palabras clave: absorción atómica, biodisponibilidad, biotransformación, metales pesados, xenobióticos.
Biotransformation of heavy metals present in mud bordering the Bogotá and Tunjuelo rivers
The presence of heavy metals in mud bordering the middle zone of Bogotá and Tunjuelo rivers, from industrial waste, has influenced and permeated the soil quality in the Bogotá plateau. This is reflected in small concentrations present in plants used for human consumption, causing adverse health effects. The biotransformation of these metals is possible due to the presence of some inorganic molecules and microorganisms capable of interacting, changing its bioavailability in the middle. In this investigation we determined the concentration of chromium, lead, and mercury by the atomic absorption technique, much used in the quantitative study of heavy metals.
Microorganisms are exposed to the presence of heavy metals, which select variants able to tolerate its adverse effects. The study of these interactions, their mechanisms of tolerance, exposes the potential for use in biotechnological processes such as bioremediation of environmental pollution by heavy metals. Through laboratory experiments, strains were able to be extracted by direct culture and selective enrichment and determine their degree of commitment to biotransformation and bioavailability of metals like chromium, lead, and mercury, concluding that one gender is more committed Micrococci, followed by Pseudomonas, without daring to mention more species due to the complexity and varieties identified in the environment.
Keywords: atomic absorption, bioavailability, biotransformation, heavy metals, xenobiotics.
Su accion directa sobre los seres vivos ocurre a través del bloqueo de las actividades biologicas, es decir, la inactivacion enzimatica por la formacion de enlaces entre el metal y los grupos sulfhidrilos (-SH) de las proteinas, causando danos irreversibles en los diferentes organismos. Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad, estos deben encontrarse disponibles para ser captados por los seres vivos, es decir que el metal debe estar biodisponible. El concepto de biodisponibilidad se encuentra íntimamente relacionado con las condiciones fisicoquimicas del ambiente, que determinan la especiacion y por lo tanto la concentracion de metal libre y labil. Por ello es fundamental, al determinar el grado de contaminación por metales pesados de un ambiente, conocer su biodisponibilidad, es decir, la concentracion de metal libre y labil presente en la muestra (1,2).
Una de las aplicaciones mas recientes en la biotecnologia es la correccion biologica que permite aborda en la mayor parte de los casos el tratamiento de suelos contaminados. Todas las interacciones entre los microorganismos y los metales u otros elementos como carbono, nitrogeno, azufre y fosforo son componentes fundamentales de los ciclos biogeoquimicos. Las interacciones metalmicrobiota son estudiadas en profundidad en el contexto de la biotecnologia ambiental, con el objeto de implementar metodos de remocion, recuperación o detoxificacion de metales pesados y radionúclidos (3-5).
Dependiendo del estado de oxidacion que se presente un metal y la especie que este conformando, un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles. Una corresponderia a la movilizacion del metal, es decir el pasaje de un estado insoluble inicial (metales asociados a suelos, sulfuros u oxidos metalicos, por ejemplo) correspondiente a una fase solida, a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviación microbiana. El otro corresponde a la inmovilización del metal, es decir el pasaje de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase solida. A su vez existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilizacion del metal puede llegar a ocurrir (6).
Figura 1: Interaccion entre los metales pesados y los microorganismos. http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/metales/metales
El interes en descontaminar los suelos se produce debido a que el flujo del agua transporta la mayoría de los contaminantes y estos tienden a absorberse sobre las superficies presentes o forman fases liquidas, quedando atrapadas en la matriz solida. Uno de los metodos de correccion biologica que se utiliza en la actualidad es la biorremediacion, la cual surge como una rama de la biotecnologia que busca resolver los problemas de contaminacion (7).
Segun la Environmental Protection Agency (EPA), la biorremediacion se define como los procesos en los que se usan microorganismos o enzimas producidas por estos para transformar o degradar contaminantes toxicos en los ecosistemas (8); esta estrategia biologica depende de las propiedades catabolicas que presentan los microorganismos, quienes utilizan los contaminantes para su desarrollo. Los contaminantes que se liberan en las superficies pueden ser transportados vertical y lateralmente a los suelos de aguas y eventualmente pueden ser inhalados o ingeridos atraves de aguas para el consumo humano, ademas pueden ser absorbidos por las plantas y los tejidos animales. Estos contaminantes son llamados tambien xenobioticos (termino que se refiere a las sustancias artificiales que no pertenecen a los sistemas biologicos naturales) (9).
En la absorcion microbiana, llamada bioacumulacion, las especies metalicas son efectivamente retenidas al interactuar con los fosfatos, proteinas y lípidos en el citoplasma celular compitiendo con los iones sodio, potasio y calcio en los mecanismos biologicos; sus posibilidades de desarrollar una mayor capacidad absorbente dependen del tipo de microorganismo y su etapa de crecimiento (10). En la Figura 1 se esquematiza la interaccion entre los metales pesados y los microorganismos, Figura 1.
Una caracteristica quimica importante de las paredes celulares es que poseen igualmente grupos funcionales; las tecnicas analiticas muestran que en ellas estan presentes polimeros sustituidos con grupos aminos, amidos, carboxilicos, hidroxilicos, fosfatos. Una vez que la biomasa obtenida principalmente de los desechos de la industria que realizan procesos de fermentacion ha sido secada, el residuo es un absorbente eficaz en la remocion de especiesmetalicas desde efluentes. Este proceso se denomina bioabsorcion; igual que en la bioacumulacion el tipo de microorganismo determina los biopolimeros presentes en la biomasa seca y asimismo la concentracion de los grupos funcionales disponibles como sitios de adsorcion. Este conocimiento ha permitido que otras investigaciones se orienten al uso directo de los biopolimeros, desarrollando aun mas la biosorcion como tecnica de metales toxicos desde efluentes mineros (10).
El ambiente mas favorable para la mayor parte de los microorganismos (bacterias, hongos y algas) (11,12) es:
-Temperatura: 15-45°C.
-pH: entre 5,5 y 8,5.
-Relacion de nutrientes carbono: nitrogeno: fosforo de 120:10:1.
-Presencia de agentes oxidantes y/o reductores que permitan las reacciones metabolicas de los microorganismos.
Ademas de estas condiciones, para que la biorrecuperacion sea efectiva, es necesario que los microorganismos sean los apropiados para el contaminante y que estos no sean toxicos para los microorganismos. El principal problema de los metales pesados en el ambiente es que no pueden ser biodegradados; sin embargo los microorganismos pueden interaccionar con ellos transformandolos los cuales obedecen a cambios en el estado de oxidacion; esto influye de forma drastica en la movilidad del contaminante, ya que en algunos casos aumenta la solubilidad de los productos de alteracion, favoreciendo asi su eliminacion del medio, y en otros casos disminuye produciéndose una inmovilizacion del contaminante. La elección entre una u otra transformacion dependera de si se pretende eliminar la contaminacion o si se quiere evitar su llegada a zonas especificas. Ademas los microorganismos pueden actuar y biodegradar la materia organica y los compuestos organicos (acidos humicos principalmente), modificando igualmente su movilidad.
Las reacciones responsables de los procesos de biotransformacion y biodegradacion estan relacionadas con el metabolismo de los microorganismos existentes. Para que dichos microorganismos puedan crecer y desarrollar sus funciones vitales necesitan un aporte de nutrientes, basicamente carbono, nitrogeno y fosforo; asi como donantes y aceptores de electrones (13). Estos ultimos son imprescindibles como fuente de energia, ya que la transferencia catalizada de electrones entre donantes y receptores libera la energia requerida para que se produzcan las reacciones bioquimicas vitales. Algunos metales pesados pueden actuar como donantes y aceptores de electrones, o como fuente de energia, y por ello es posible su biotransformacion. Los organismos que utilizan metales como fuentes principales de energía son los denominados chemolitoautotrofos.
Las principales transformaciones de los metales pueden ser directas, por medio de cambios en el estado de valencia cuando actuan como donantes o receptores de electrones e indirectas, por medio de agentes oxidantes y reductores producidos por los microorganismos y que son responsables de cambios en el pH y del potencial redox (11). En la respiración aerobia los organismos chemolitoautotrofos utilizan CO2 como fuente de alimentacion y de energia. En la respiracion anaerobia, los procesos están condicionados por el tipo de aceptor de electrones, ya que no existe oxigeno disponible para hacer dicha funcion. Los principales aceptores de electrones en medios anaerobios son CO2; NO3- ; S04 2- y Fe3+. Las formas oxidadas de los metales son altamente solubles y por lo tanto moviles, en las aguas subterraneas en condiciones aerobias. Su reducción enzimatica produce formas reducidas insolubles, lo que provoca su precipitacion intra o extracelular (11).
Ademas de la reduccion enzimatica directa de metales pesados, algunos microorganismos, como las bacterias reductoras de metales y las bacterias reductoras de sulfatos, pueden llevar a cabo la reduccion indirecta de especies oxidadas solubles. Esto se produce acoplando la oxidacion de compuestos organicos a la reducción del Fe3+, Mn4+ y S042-. Las especies reducidas Fe2+, Mn2+ y H2S, interaccionan quimicamente con los metales contaminantes solubles produciendo especies multicomponentes insolubles que precipitan.
La solubilizacion de metales bioabsorbidos y coprecipitados puede producirse por procesos microbianos tanto de forma directa como indirecta, aunque la solubilizacion de metales pesados a partir de coprecipitados con las fases minerales del acuifero, requiere una solubilizacion parcial previa de dichas fases minerales, oxidos principalmente. La reduccion directa de oxidos de hierro por bacterias reductoras de metales, favorece la solubilizacion de un gran rango de metales pesados que pudieran estar coprecipitados en dichos oxidos. Asimismo, la creacion de acidos organicos durante el metabolismo de los microorganismos, es capaz de bajar el pH del sistema, hasta valores que permitan interferir con las cargas electrostaticas que mantienen unidos los metales pesados a la superficie de los oxidos e hidroxidos de hierro y ser desplazados por los iones de hidrogeno liberados al sistema.
Partiendo de la determinacion de la zona de muestreo y haciendo una caracterizacion fisica, quimica y climatica de la zona, se pudo estandarizar los protocolos microbiologicos a seguir en el laboratorio, y se utilizo la absorcion atomica como tecnica para la determinación de estos metales pesados. Con la zona de muestreo estudiada, los protocolos microbiologicos establecidos, se procedio a la toma de las muestras de los lodos semiliquidos dadas las condiciones de las riveras de estos dos rios. Se tomaron muestras por duplicado en frascos de 500 mL, color ambar y conservados a 40C, (una para quimica y otro para microbiologia). Las muestras fueron recogidas con herramientas manejables (paletas o espatulas) previamente esterilizadas en el laboratorio o bien a la llama inmediatamente antes de la toma. En el caso de los suelos siempre se trato de muestras superficiales (20 o 30 cm).
El proceso de preparacion paso por un pequeño cribado manual para retirar trozos de roca y vegetales de modo que la muestra presentara un aspecto homogeneo, sin fragmentos superiores a 5mm. Es importante conseguir una solucion convenientemente clara, representativa y reproducible para los cultivos en placa. Para ello, a un peso de cada muestra (10 g) se le anadio una cantidad de un agente disgregante(pirofosfato de sodio -Na4P2O7.10H2O al 0,1%) en una relacion constante volumen/peso de 2,5 (14). El recipiente esteril se agito, machacando las partículas de suelo con una varilla de vidrio tambien esteril hasta reposar y se observo el grado de dispersion alcanzado.
El proceso se detuvo cuando se dispersaron por completo las particulas mayores. Este procedimiento actua a escala macroscopica (15) la dispersion de las particulas de suelo y la ruptura de agregados que pudieran disminuir la eficiencia de la extraccion de los microorganismos. En el ambito microscopico se consigue una desorcion de las celulas suficiente para conseguir una suspension microbiana.
Las muestras se sometieron a analisis química para poder establecer el nivel de contaminación de estos lodos por Cr hexavalente, Pl y Hg. Las muestras microbiologicas se concentraron mediante centrifugacion a 12000 rpm durante 5 minutos en forma fraccionada y se tomo el sobrenadante, llevando a un volumen final de 50 mL, para iniciar el proceso de diluciones y siembra en medio TSA e incubarlos por 48 horas a una temperatura de 250C. Se realizaron repiques y aislamiento de los microorganismos presentes (biotransformantes y biotolerantes), para ser sometidos a pruebas bioquimicas (16) iniciales de identificacion y establecer las tecnicas de enriquecimiento selectivo en matraces de 250 mm con medio de cultivo (lodo esteril) a 5000 rpm y 25oC durante siete dias, al cabo de los cuales se tomo 1 mL para diluciones (17), siembra, recuento aislamiento e identificacion (15, 18, 19).
Todos los procedimientos que se pueden usar para el calculo del numero de microorganismos viables en una muestra natural tienen implícitos errores; los recuentos en placa no son excepcion.
Efectivamente, el numero de microorganismos que se pueden aislar con esta tecnica es muy inferior al total de los presentes en la misma muestra; tanto es asi que, segun los casos, se habla de un 10% a 15% del total (20,21). Se tomaron 25 mL del matraz y se resembro en un nuevo matraz medio de cultivo liquido (lodos esterilizados), repitiendo tres veces el procedimiento anterior, (enriquecimiento selectivo). Se implementaron nuevos matraces de 250 mL, con medio de cultivo esteril, (lodos analizados quimicamente para garantizar la ausencia de metales pesados) suplementados con adicion de concentraciones especificas de Cr, Pl y Hg para observar el comportamiento de los microorganismos aislados (biotolerantes y biotransformadores).
Es importante senalar que el contenido de cada matraz fue enviado a analisis quimico para hacer seguimiento a la biotransformacion de cada uno de estos metales. Se utilizaron técnicas de biologia molecular, para la identificacion de los microorganismos asi como el analisis de sus relaciones filogeneticas, mediante la secuenciación el ARN ribosomico (rRNA), o de los genes que se codifican, rDNA. El proceso completo paso por fases de amplificacion (PCR) del gen del RNAr 16S, secuenciacion y finalmente comparacion con las secuencias de referencia en las bases de datos existentes (15).
La aportacion principal de estas tecnicas en el campo de biorremediacion es la identificación precisa de los microorganismos implicados en la biotransformacion. Los arboles filogeneticos que se pueden elaborar con esta metodologia permiten conocer las relaciones de las bacterias detectadas con otros grupos microbianos, incluso sin haber sido cultivadas previamente.
Los métodos utilizados para identificar las cepas aisladas tras diversas fases de cultivo fueron: obtencion de ADN (22), amplificación -purificación: mediante el uso del kit GFX PCR DNA and Gel
Band purification (Amersham Bioscience) segun el protocolo del fabricante y leyendo el ADN obtenido en 60 μL de agua destilada; secuenciacion: 10 μL de ADN purificado (a una concentracion aproximada de 30 ng/μL) mediante el uso del kit Thermo sequenase dye terminator cycle sequencing premix (Amersham Bioscience) y 5 μL del cebador pH a una concentracion de 5 pM en un secuenciador automatico de ADN Multigene Termal Cycler TC9600; analisis de las secuencias de ADN: las secuencias obtenidas se introdujeron en el programa BLAST (NCBI) que busca homologias al nivel de nucleotidos o de aminoacidos con secuencias presentes en bases de datos (23).
- Cromo hexavalente mayor a 0.005 mg de Cr/L.
- Plomo: mayor a 0.049 mg de Pl/L
- Mercurio: mayor a 0.001 mg de Hg/L.
La evidencia de su presencia es superior a lo establecido por la norma. Igualmente a las muestras se les realizo pruebas para determinar su pH (Laboratorio de Microbiologia de la Facultad de Ingenieria Ambiental de la Universidad Antonio Narino), obteniendose los siguientes resultados:
- Muestra A1 (azul): 7.17
- Muestra A1 (blanca): 7.04
- Muestra B1: 6.83.
Los resultados son la expresion de un ANAVA aplicado al numero total de muestras y su ponderacion. Igualmente, de estas muestras, tomadas en forma consecutiva (cada 15 dias), se obtuvieron diferentes colonias, el predominio fenotipico y comportamiento a la prueba bioquimica de Gram y oxidasa se muestran en la Tabla 1.
Se realizaron repiques para hacer pruebas de identificacion mediante la tecnica de CRYSTAL RAPID, determinandose de esta forma la presunta presencia de los siguientes microorganismos:
Corynebacterium genitalium, Corynebacterium diphteriae, Bacillus megaterium, Micrococcus sedentarius, Bacillus meguterium, Aeromonas hydrophila, Aeromonas spp., Pantoea agglomerans
y Pseudomonas spp.
Los anteriores resultados son producto de la ponderacion del recuento directo de la siembra en medio de cultivo TSA, por triplicado: La literatura reporta la relacion de algunos de estos microorganismos en la presencia de metales pesados, bien sea como tolerantes o como biotransformadores, y entre ellos tenemos como ejemplo a Corynebacterium genitalium, que presenta sensibilidad al cromatoy resistencia al mercurio, resistencia al plomo, Gram positivo; Corynebacterium diphteriae, ha sido aislado de suelos contaminados con metales pesados (cromo VI); Aeromonas hydrophila: Gram negativa, sensibilidad al cromato, resistencia al mercurio y resistencia al plomo; Pantoea agglomerans, crece entre 180C–250C, bacilos Gram negativo, aislado en suelos contaminados con cromo VI; Pseudomonas sp, resistencia a cromo VI (11,24), Figura 2.
Tabla 1. Caracteristicas morfologicas de los microorganismos aislados.
Figura 2. Resultado de dominancia de diferentes generos de microorganismos en Recuentos Directos en Medio TSA.
Igualmente se realizaron diferentes aislamientos por enriquecimiento, y las especies que demostraron que intervienen, de alguna forma, en tolerancia en el proceso de biotransformacion se relacionan en las Tablas 2-6.
Tabla 2. Primer enriquecimiento.
Tabla 3. Cepas aisladas del segundo enriquecimiento.
Tabla 4. Del tercer enriquecimiento tenemos.
Tablas 5 y 6. Resultados del cuarto enriquecimiento.
De los resultados, tanto de los aislamientos por triplicado directos, como de los diferentes enriquecimientos, evaluadios mediante un análisis de varianza, se obtuvo la siguiente informacion: de los enriquecimientos directos se presenta una estandarizacion cuantitativa en la presencia de los generos Corynebacterium, Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Micobacterium, Aspergillus, sin embargo la presencia del genero Micrococcus, paso casi que inadvertida, lo cual fue cambiando a traves de los enriquecimientos selectivos y de los enriquecidos con metales, llegando a dominar con su presencia.
Figura 3. Generos predominantes en la biotransformacion de los metales Cr, Pl y Hg.
Con lo anterior, se ratifica la importancia de no descartar ningun microorganismo de los aislamientos directos, los cuales pueden aparecer en forma poco significativa frente a las dominantes que pueden estar degradando metabolitos intermedios u otros sustratos presentes producto de la degradacion del mismo medio, Figura 3.
La biotransformacion de estos metales, tanto en los enriquecimientos con medio de cultivo con lodos como en los que se les adiciono Cr, Pl y Hg a los lodos esterilizados, fue casi total, demostrando la eficiacia de todos los generos presentes bien sea trasformado los metales directamente o suplementando otros bioelementos para facilitar este proceso.